体内外的研究同时证明H2AX的修饰在调节电离辐射诱导DNA双链断裂引起的细胞损伤应答中起着核心作用，其中包括DNA修复，细胞周期检测，抑制肿瘤等。鉴于H2AX在电离辐射中的重要作用，我们假设沉默H2AX后可能会影响电离辐射导致的细胞损伤应答和DNA修复，从而间接提高放疗敏感性。为此，本实验首先观察了不同食管癌细胞ECA109和TE13---两种代表不同分化程度的食管鳞状细胞癌，在不同时间-剂量条件下电离辐射对H2AX蛋白表达水平和核内斑点形成的影响。其次，通过RNA干扰技术成功构建了H2AX稳定低表达的人食管癌ECA109细胞系。最后通过体外实验观察沉默前后H2AX与MDC1和53BP1蛋白表达的关系、核内斑点形成的变化、电离辐射对细胞周期的影响；同时也观察了沉默H2AX基因后对裸鼠移植瘤从肿瘤体积、重要蛋白之间的关系到对细胞周期的影响，发现体内外实验的结果均证实沉默H2AX可以提高食管癌ECA109细胞放疗敏感性，并探讨其中具体的机制，为将来可能的基因治疗提供了更多的理论支持。第一部分食管癌细胞中γH2AX蛋白表达及核内斑点电离辐射后剂量时间效应关系目的：观察不同食管癌细胞系中接受电离辐射后γH2AX蛋白表达和核内斑点的时间剂量效应关系。方法：应用western blotting法检测食管癌细胞γH2AX蛋白表达随时间和剂量的变化情况，共聚焦显微镜检测食管癌细胞接受不同剂量照射后γH2AX核内斑点随时间的变化情况。结果：1.不同食管癌细胞系未照射时存在一定量的γH2AX蛋白表达。2.随着辐射剂量的增加γH2AX蛋白表达量峰值的时间提前。3.电离辐射后1h检测两个细胞系均发现γH2AX蛋白表达存在剂量依赖，剂量越大，蛋白表达量越高。4.ECA109细胞辐射后γH2AX蛋白表达存在着产生快、消退慢的特点。照射后24h内γH2AX蛋白表达水平均恢复到照射前水平。5.TE13细胞内γH2AX蛋白衰退的时间远远大于ECA109细胞，所有接受照射的TE13细胞24h内均不能恢复到照射前水平。6. ECA109细胞中电离辐射诱导的γH2AX核内斑点数量存在剂量依从性，接受照射剂量越大，斑点数量越多。接受8Gy照射后γH2AX核内斑点存在着产生快、消退慢的特点。照射后24h内γH2AX核内斑点恢复到照射前水平。7. TE13细胞接受照射剂量越大，产生的γH2AX核内斑点越多；接受8Gy照射后TE13细胞产生核内斑点数量随时间延长逐渐增多结论：ECA109细胞及TE13细胞照射后γH2AX表达均存在时间剂量效应关系，前者随照射剂量增加表达峰值时间提前，且下降变缓；而TE13细胞随剂量增加表达量明显增多，且峰值后延，无明显下降趋势。第二部分H2AX shRNA病毒载体构建及H2AX低表达的食管癌ECA109细胞系的建立目的：通过RNA干扰技术构建H2AX低表达的食管癌ECA109细胞系，为体内外实验研究沉默H2AX与放疗敏感性的关系提供前提条件。方法：应用RNA干扰技术设计多个沉默H2AX基因序列，与质粒连接后转染工具细胞，通过western blotting的方法筛选沉默效果最佳的靶基因，将靶基因植入慢病毒载体，随后转染食管癌细胞，经过抗生素筛选获得H2AX蛋白低表达的食管癌ECA109细胞系。并采用RT-PCR及western blotting的方法从RNA水平和蛋白水平检测转染原代、5代、10代及15代后这种基因沉默的效果。结果：1.成功构建带有沉默H2AX基因序列的双标记mU6-MCS-Ubi-EGFP-IRES-Puro-H2AX质粒。2.采用western blotting法筛选出沉默效果最佳的靶基因PSC-3基因序列。3.通过RT-PCR和western blotting方法检测转染后H2AX在RNA水平和蛋白水平的沉默效果。基因H2AX低表达的食管癌细胞系在RNA水平和蛋白水平分别下降了52%和70%。4.检测转染原代、传代5代、10代、15代后H2AX在RNA水平和蛋白水平的沉默效果没有减弱。结论：我们设计的沉默H2AX的RNA序列能够达到降低H2AX基因表达的作用，成功构建了H2AX稳定低表达的食管癌ECA109细胞系。第三部分沉默H2AX基因对体外ECA109食管癌细胞放疗敏感性的影响目的:观察沉默H2AX后相关蛋白（γH2AX、MDC1和53BP1）表达、相互作用的变化、核内斑点情况及细胞周期改变。方法：1.采用western blotting法检测沉默H2AX后空白对照组Control(ECA109组)、空病毒载体组(ECA109-NC组)和H2AX沉默组(ECA109-H组)三组细胞接受电离辐射8Gy后1h时γH2AX、MDC1和53BP1蛋白表达的改变；2.免疫共沉淀法（COIP）检测沉默H2AX后γH2AX、MDC1和53BP1电离辐射前后相互作用的变化；3.共聚焦显微镜检测沉默H2AX后γH2AX、MDC1和53BP1核内斑点的情况；4.流式细胞技术检测照射8Gy后24h细胞周期的变化；5.MTT法和克隆形成实验检测沉默H2AX后细胞增殖和放疗敏感性的变化。结果：1.沉默H2AX组细胞内γH2AX表达量低于对照组，照射后可使γH2AX蛋白表达增高，而沉默H2AX后这种增高程度降低，空病毒转染对细胞蛋白表达无影响。沉默H2AX基因对MDC1和53BP1蛋白表达无影响。2.照射前γH2AX蛋白表达与MDC1、53BP1蛋白表达未见明显相关性，照射后三种蛋白表达密切相关。沉默H2AX后这种相关性减弱。3.1接受8Gy电离辐射后发现ECA109细胞内产生的γH2AX、MDC1和53BP1的核内斑点随时间发生变化，1h斑点数量最多，随时间延长斑点数量逐渐减少，到观察点12h，基本接近照射前水平，三者的规律是一致的。3.2接受8Gy照射后1h检测到沉默组细胞内γH2AX、MDC1和53BP1核内斑点明显减少。4.1接受8Gy照射后24h检测沉默H2AX对凋亡率无明显影响。4.2照射后24h，照射组G0/G1期的比例均较未照射组下降，沉默H2AX使得这种下降趋势减弱；而照射后G2/M期比例均较未照射组升高，沉默H2AX使这种升高趋势减弱；各组细胞照射后的S期未见明显差别(p＞0.05)。5.沉默H2AX对食管癌细胞ECA109细胞增殖未见明显影响。6.克隆形成实验证实沉默H2AX后放射敏感性增高。空病毒转染对细胞无论从蛋白表达还是细胞周期方面均无影响。结论：H2AX shRNA转染食管癌ECA109后，γH2AX表达降低，与MDC1、53BP1相互作用减弱，照射后G2/M期阻滞减弱，放射敏感性增加。第四部分沉默H2AX基因食管癌细胞ECA109的体内放射增敏效应目的：研究沉默H2AX后对裸鼠移植瘤从蛋白表达、肿瘤大小到细胞周期的影响。从体内试验证明沉默H2AX可以达到放疗增敏的作用。方法：1.将60只裸鼠分为①空白对照组Control(ECA109)；②单纯照射组(Control+R)；③空病毒载体组(NC)；④空病毒载体照射组(NC+R)；⑤沉默H2AX组(H)；⑥沉默H2AX照射组(H+R)；每组各10只BALB/c/nu裸鼠。分别接种相应细胞，接种细胞数为2×106/50μl/只，制备裸鼠食管癌模型。2.观察各组肿瘤生长情况。3.接种后22天给予6MV-X线15Gy单次照射，照射后24h每组处死5只裸鼠，将肿瘤标本按Western blottingting、RT-PCR及流式细胞分析要求分装，处理，分别检测蛋白水平、RNA水平及细胞周期改变。结果：1.所有裸鼠均成活并有肿瘤形成。沉默H2AX组肿瘤体积较小，而空病毒转染对肿瘤生长无明显影响。2.检测离体肿瘤组织发现沉默H2AX组肿瘤中H2AX无论在蛋白水平还是RNA水平均低表达，分别下降了60%和90%。3.肿瘤组织的COIP显示照射前γH2AX与MDC1、53BP1之间无相关性，照射15Gy后24h检测三者存在明显相互作用。沉默H2AX后，它们之间的相互作用减弱。4.空白组肿瘤生长速度最快，沉默H2AX使肿瘤生长减慢；照射后肿瘤生长速度下降，而沉默H2AX使这种趋势更加明显，肿瘤体积较照射前缩小。5.体内凋亡率检测发现沉默H2AX后凋亡率增高。6.照射后G0/G1期比例下降；照射后引起G2/M期阻滞，沉默H2AX使阻滞减轻(p＜0.05)；照射后空白对照组S期比例较未照射组降低，沉默H2AX组照射后S期比例反而升高。空病毒转染对蛋白表达和细胞周期均无显著影响。结论：H2AX shRNA稳定转染的ECA109裸鼠移植瘤生长减慢，照射后肿瘤生长延迟，在终点时间点观察到肿瘤缩小；γH2AX表达下降且与MDC1、53BP1相互作用减弱，照射后G2/M期阻滞减轻。