AP-1蛋白由bZip(basic region—leuzinezip)家族成员形成的同二聚体或异二聚体组成，包括Jun，Fos，ATF及Maf等亚家族。它们大部分是转录因子，这些转录因子除了含有典型的转录激活域和碱性DNA结合区(basic region)之外，还有一个特殊的亮氨酸拉链结构域(leuzinezip)，这样的结构决定了它们必须形成二聚体才能结合到顺式作用元件(cis—elements)上。研究表明c—Jun/ATF2形成二聚体与靶基因启动子的ATF位点结合；c—Jun/c—Fos主要结合经典的TRE序列，因此，搭档(partner)的不同决定了c—Jun异二聚体与靶序列结合的特异性，从而选择性激活不同靶基因的表达。 c—Fos是AP-1蛋白家族的重要成员之一，其活性受多种因素调节，同时也参与多种生物学过程。c—Fos与许多生物学现象有关，如在成骨细胞和成纤维细胞中参与细胞的转化；调节细胞的增殖]和细胞周期；促进许多细胞系的分化及参与调节轴突伸长等。但c—Fos与神经元凋亡的关系及其机制尚不明确。 小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons，CGNs)在去极化浓度的KCl(25 mMKCl，25 K)培养下维持存活，当换成低浓度KCl(5 mM KCl，5K)时，CGNs发生典型的凋亡。利用这一模型，我们前期的实验结果证明：撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，c—Jun与ATF2形成二聚体与靶基因启动子的ATF位点结合而触发靶基因表达并介导神经元凋亡。通过结构分析并结合文献报道，我们发现，c—Fos与c—Jun的亲和力要大于ATF2与c—Jun的亲和力，那么c—Fos作为另一重要的AP-1蛋白，其存在对形成二聚体的c—Jun/ATF2及其介导的神经元凋亡是否有影响？ 因此，本课题主要研究目的为： 1.阐明c—Fos表达对c—Jun/ATF2二聚体的影响。 2.研究c—Fos在小脑颗粒神经元凋亡中的作用。 实验方法和结果： 1.撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡模型中，c—Fos表达下调 c—Fos在神经元中凋亡中的作用尚不明确，为研究其作用及机制，我们首先观察它在小脑颗粒神经元中的表达情况。体外培养7天的小脑颗粒神经元，换液到含有去极化浓度即25 mM KCl(25 K)或复极化浓度即5 mM KCl(5 K)的培养基中孵育1、2、4小时，然后提取细胞总的RNA进行RT—PCR，检测c—fos mRNA的变化情况。检测结果显示，c—fos表达在5K处理1小时时即明显下调，随着撤钾时间延长，这种下调是持续的。同样的，撤钾时，c—Fos蛋白水平在1小时即急剧下调，而且这种下调一直持续至4小时，与mRNA变化完全一致，表明撤钾诱导神经元凋亡的早期，c—Fos在转录水平发生下调。 已有报道，去极化诱导Ca2+内流，通过L型钙通道维持去极化时c—Fos在神经元内的表达。我们分别采用了L型钙通道抑制剂Nifedipine(Nif)和特异性Ca2+/calmodulin—dependent protein kinases(CaMKs)抑制剂KN62(KN)，来验证去极化时是否CaMKs介导了c—Fos的表达。小脑颗粒神经元体外培养第7天，吸去完全培养基，用相应5K、25K洗一遍，分别用SK、25K、25K+1μmol/L Nifedipine、25K+10μmol/L KN62处理，无抑制剂处理组，用终浓度小于1‰的DMSO(二甲基亚砜)做为溶剂对照。处理4小时后，提取细胞总的RNA进行RT—PCR，检测c—fosmRNA的变化情况。结果提示：CaMKs介导了去极化诱导的c—fos mRNA变化。抑制CaMKs活性观察c—Fos蛋白变化，得到与mRNA相一致的结果。 2.c—Fos干扰c—Jun/ATF2二聚体形成 我们前期研究表明c—Jun/ATF2形成异二聚体并介导了神经元的凋亡，那么同为AP-1家族蛋白的c—Fos在其中发挥怎样的作用？通过对c—Jun ATF2及c—Fos的结构分析发现，由于其亮氨酸拉链结构域中参与形成二聚体的关键位点上残基的带电性不同，c—Fos与c—Jun的亲和力要远远大于ATF2同c—J un的亲和力，其突变体A—Fos与c—Jun亲和力则更高。在撤钾时，c—Jun和ATF2被激活并表达增加，与之相反的，c—Fos却急剧下调，由此我们提出：c—Fos的下调是否有利于c—Jun/ATF2二聚体才形成？反之，c—Fos的存在是否干扰c—Jun/ATF2二聚体形成？ 为证实这个设想，我们采用竞争性CoIP实验：HEK293细胞融合度达到90％时，用脂质体转染法共转染V5-C2/c—Jun、Flag—C2/ATF2质粒，加或不加质粒Flag—c—Fos或Flag—A—Fos。36小时后，收集细胞做免疫共沉淀，用V5抗体进行IP后，Western blot用Flag抗体检测C2/ATF2、c—Fos、A—Fos及C2/c—Jun表达量。结果显示：IP C2/c—Jun检测到C2/ATF2，说明C2/c—Jun和C2/ATF2形成了二聚体，加入c—Fos或A—Fos后沉淀复合物中的C2/ATF2明显减弱，有力地证明了c—Fos或A—Fos竞争性抑制c—Jun/ATF2二聚体形成。 3.c—Fos抑制c—Jun/ATF2下游靶基因表达 为了进一步说明c—Fos干扰c—Jun/ATF2二聚体形成，我们观察神经元内c—Fos对c—Jun/ATF2下游靶基因的影响。由于神经元转染率低，我们构建了重组腺病毒Ad—c—Fos和Ad—A—Fos。本实验室已报道dp5和atf3是c—Jun/ATF2的下游靶基因，通过RT—PCR方法观察c—Fos和A—Fos是否抑制dp5和atf3的表达。体外培养第5天的小脑颗粒神经元感染腺病毒Ad—GFP或Ad—Fos，MOI=100、滴度为20，000。腺病毒在细胞内表达36小时后，换25K、5K模型4小时。收集细胞提取总RNA，逆转录后用特异性引物PCR扩增得到相应产物，结果显示：Ad—c—Fos、Ad—A—Fos均明显抑制了dp5和atf3 mRNA水平。 4.c—Fos保护小脑颗粒神经元 前面已证实c—Fos能抑制c—Jun/ATF2二聚体形成及其下游促凋亡靶基因表达，那么c—Fos是否通过这一机制保护性干预保护神经元凋亡呢？为阐明c—Fos是否保护神经元，我们过表达c—Fos或A—Fos观察其对神经元凋亡影响。在体外培养第5天的小脑颗粒神经元，用钙磷沉淀共转染GFP与pcDNA3.1-Flag—c—Fos或pcDNA3.1-Flag空载体。48小时后，换成25 K、5K模型12小时。加入Hoechst33258(5μg/ml)进行活细胞染色半小时以观察核形态，倒置荧光显微镜下(300×)观察并拍照。以GFP阳性细胞为总数，计算凋亡率。结果显示c—Fos有效的干预了撤钾诱导的神经元凋亡。同时我们还过表达了质粒pcDNA3.1-Flag—A—Fos，结果表明，A—Fos较c—Fos更有效的保护了神经元。 由于神经元存在转染率低的局限性，而腺病毒则以其高感染率使其应用广泛而可靠。体外培养第5天的小脑颗粒神经元感染腺病毒Ad—GFP或Ad—Fos，MOI=100、滴度为20，000。腺病毒在细胞内表达36小时后，换25K、SK模型12小时。加入Hoechst33258(5μg/ml)进行活细胞染色半小时以观察核形态，倒置荧光显微镜下(300×)观察并拍照，计算凋亡率。结果进一步肯定了c—Fos及A—Fos保护神经元的这一现象。 结论： 1.撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，c—Fos表达下调。 2.c—Fos干扰c—Jun/ATF2二聚体形成并抑制其下游靶基因。 3.过表达c—Fos保护小脑颗粒神经元。