论文部分内容阅读
第一部分TESTIN基因在子宫内膜癌中的表达水平目的:探讨子宫内膜癌中TESTIN基因的表达水平,为子宫内膜癌的早期诊断提供依据。方法:收集68例子宫内膜癌患者的子宫内膜癌组织68例及相应的癌旁组织68例,其中子宫内膜样腺癌60例,子宫浆液性乳头状腺癌8例。免疫组化法检测子宫内膜癌组织及其癌旁正常组织中TESTIN基因的蛋白表达水平并对TESTIN基因表达与临床参数之间的关系进行统计学分析。采用甲基化特异性PCR检测子宫内膜癌组织、细胞中TESTIN基因启动子的甲基化状态,分析其与TESTIN表达水平之间的相关性。结果:子宫内膜癌的癌旁正常组织中TESTIN蛋白呈阳性表达,而绝大部分(52/68)的子宫内膜癌组织中TESTIN蛋白表达显著下降(p<0.O1)。进一步分析显示:子宫内膜样腺癌组中TESTIN蛋白表达水平下降率较浆液性乳头状腺癌组明显升高(χ2=13.34,p=0.001)。根据MSP的结果,44.1%(30/68)的子宫内膜癌中TESNTIN启动子为高甲基化状态,而在正常内膜组织中仅为3.6%(1/28),p<0.001)。统计学分析显示TESNTIN启动子高甲基化与淋巴结转移(p=0.03)显著相关。同时,TESTIN表达水平下降与其高甲基化状态相关(p=0.021)。甲基化处理可恢复AN3CA细胞内TESTIN表达。结论:TESTIN基因在子宫内膜癌中表达显著下降,启动子区域的高甲基化是TESTIN基因在子宫内膜癌中表达缺失的主要原因。第二部分TESTIN在子宫内膜癌中的作用机制目的:探讨TESTIN甲基化在子宫内膜癌中的作用及其分子机制。方法:分别构建TESTIN过表达质粒pc DNA3.1-TESTIN和干扰质粒sh RNA-TESTIN;将上述两种质粒转染子宫内膜癌细胞并构建稳定的转染细胞株,应用实时PCR方法和western blot方法检测转染前后TESTIN基因的表达。应用MTT法、克隆形成实验、Transwell实验、实时PCR和western blot等方法检测TESTIN对子宫内膜癌细胞的生长、克隆形成和侵袭能力的影响,光学显微镜下观察子宫内膜癌细胞的形态学变化,实时PCR和western blot方法检测与EMT相关的E-钙粘连蛋白、Snail,波蛋白和N-钙粘连蛋白的m RNA和蛋白表达水平的变化。分别使用TESTIN稳定过表达和干扰的子宫内膜癌细胞株建立建立子宫内膜癌裸鼠模型,观察TESTIN对肿瘤生长的抑制作用,验证TESTIN对EMT过程的调控。结果:在AN3CA细胞中,TESTIN过表达可明显抑制细胞的生长、克隆形成和侵袭能力;同时,TESTIN过表达后诱导AN3CA细胞出现上皮性转变,上皮性标志物E-cadherin的表达水平明显上升,而间质性标志物Snail,N-cadherin,vimentin的表达则被显著抑制;相反地,在TESTIN敲低的Ishikawa细胞中,细胞的生长、克隆形成和侵袭能力得到增强;同时,干扰TESTIN基因后Ishikawa细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态方向转化,作为上皮性细胞标志物的E-cadherin的表达显著下降,而间质性细胞标志物vimentin,N-cadherin,snail的表达显著上升。在子宫内膜癌动物模型中,TESTIN过表达显著抑制了AN3CA移植瘤的生长速度,而TESTIN沉默则加快了Ishikawa移植瘤的生长。结论:TESTIN在子宫内膜癌中发挥抑癌基因的角色,其同时可对EMT过程进行负调控。