近5年来,在实体肿瘤干细胞研究领域取得了瞩目的成就,越来越多的研究证实在乳腺癌、脑肿瘤、皮肤癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌等实体瘤中存在着肿瘤干细胞,极大地促进了人们对肿瘤起源的认识和治疗观念的变革。但肿瘤干细胞数量上的稀少和不断分化的特性,阻碍了进一步的分子水平上的研究。而现有的分离和鉴定方法,利用细胞表面标记物和干细胞排染能力,所鉴定出来的只是富含肿瘤干细胞的一群细胞,不是真正意义上的单个细胞即可致瘤的肿瘤干细胞,尚缺乏令人信服的实验证据来支持肿瘤干细胞理论。本研究以肿瘤干细胞理论为依据,在体外悬浮培养富集致瘤性肿瘤细胞的基础上,探索联合应用化疗药物筛选乳腺癌干细胞的可行性。1、无血清悬浮培养分离和体外扩增致瘤性小鼠乳腺癌TM40D细胞【目的】无血清悬浮培养TM40D小鼠乳腺癌细胞,富集致瘤性肿瘤细胞。【材料与方法】直接适应法无血清培养TM40D细胞,分选出CD44~+CD24~-和CD44~+CD24~+亚群,每群中一半细胞无血清培养,另一半细胞有血清培养,连同悬浮培养的TM40D细胞,测定连续传代时其中假定的乳腺癌干细胞标记物CD44~+CD24~-的表达。免疫组化检测TM40D细胞、悬浮培养细胞和CD44~+CD24~-细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和细胞角蛋白(CK)18表达。膜联蛋白V(Annexin-V)异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)法检测细胞凋亡。【结果】TM40D细胞能直接适应无血清悬浮培养,第4天时约77%的细胞发生凋亡和坏死,第5天出现肿瘤球。TM40D细胞中CD44~+CD24~-比例约为1.2%,TM40D悬浮培养细胞和分选的CD44~+CD24~-细胞悬浮培养时,随着传代次数的增加,其中CD44~+CD24~-比例显著增加,至第10代时为最多(分选的CD44~+CD24~-中达85.17%,TM40D细胞中为77%),以后比例趋于稳定。TM40D细胞贴壁培养时表达α-SMA和CK18,悬浮培养时则失去表达。【结论】悬浮培养能富集假定的CD44~+CD24~-乳腺癌干细胞群,保持一定的未分化状态,乳腺癌细胞体外悬浮生长模式图可以很好地解释乳腺癌干细胞在无血清培养条件下的体外扩增。2、悬浮培养联合化疗药物筛选乳腺癌干细胞【目的】在悬浮培养基础之上,确定适宜的化疗药物浓度筛选出乳腺癌干细胞【材料与方法】取第10代悬浮培养细胞作为实验对象,用不同血药峰浓度(PPC)的联合化疗药物紫杉醇和表柔比星处理24小时,然后继续无血清培养,7天后Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡。【结果】1 PPC和0.5 PPC细胞全部凋亡,0.25 PPC和0.1 PPC细胞在检测期内出现增殖形成细胞球。0.35 PPC细胞98%以上凋亡。【结论】0.35 PPC细胞符合既定筛选标准,用于动物致瘤实验。3、乳腺癌干细胞的动物致瘤实验【目的】观察所筛选细胞的体内致瘤能力。【材料与方法】将0.35 PPC细胞以不同的数量接种于免疫功能正常或抑制的BALB/C小鼠腹壁皮下,观察肿瘤生长情况。同时设CD44~+CD24~-和CD44~+CD24~+细胞为对照组。所有标本组织经病理切片检查。【结果】接种0.35 PPC细胞1个时,10只免疫功能正常小鼠中有1只,10只免疫功能抑制小鼠中有2只生成乳腺癌。无论小鼠免疫功能正常与否,接种1000、100个CD44~+CD24~+细胞时均无肿瘤生成。接种CD44~+CD24~-细胞1000、100个时,7只免疫功能正常小鼠中分别有7只和5只长出肿瘤。而接种10个CD44~+CD24~-细胞时7只免疫功能正常小鼠均无肿瘤生成。【结论】0.35 PPC单个细胞即可致瘤,悬浮培养联合化疗药物筛选乳腺癌干细胞的方法是可行的。