目的 建立高氧诱导的小鼠视网膜新生血管动物模型，观察动物模型视网膜新生血管的形成、发展及消退情况；在此基础上，观察不同浓度的Kringle 1-5对小鼠视网膜新生血管的抑制作用及在新生血管形成不同时期应用时作用的差别，并检测用药后小鼠视网膜血管内皮细胞的凋亡情况，以探讨Kringle 1-5抑制视网膜新生血管的作用机制。 材料和方法 一、高氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型的建立与观察1．动物模型的建立健康C57BL/6J新生小鼠24只，性别不限，随机分为高氧模型组与正常对照组，每组12只(24眼)。高氧模型组小鼠于生后7天与同笼的一只母鼠一起进入塑料制作的密闭氧箱，另选生育有同龄幼鼠的母鼠生活在正常大气环境中做替换母鼠。氧箱内通入85％的湿润氧气，每日检测氧浓度3～4次，维持氧箱内氧气的体积分数为(75±2)％。每天一次打开氧箱加食、换水、替换母鼠，5天后将小鼠返回正常大气环境中。正常对照组小鼠普通大气环境中饲养。所有小鼠均于自然光照明下饲养，温度控制在23℃±2℃。 2．视网膜新生血管的观察于小鼠生后15、17、19、21、24、30天时，分别取高氧模型组和正常对照组各2只小鼠(4眼)，麻醉后经上腔静脉注射2％伊文思蓝(Evans blue)溶液，待循环5分钟后处死小鼠，摘取眼球，置4％多聚甲醛固定。固定3小时后分离视网膜并铺片，荧光显微镜下观察视网膜血管情况。 二、Kringle 1-5抑制小鼠视网膜新生血管的实验研究1．不同浓瘦的Kringle 1-5对视网膜新生血管形成的影响健康C57BL/6J新生小鼠60只，性别不限，随机分为正常对照组、高氧对照组、0.1μg治疗组、0.5μg治疗组、2.5μg治疗组和5μg治疗组，每组10只。正常对照组新生小鼠正常大气环境饲养；高氧对照组及各治疗组小鼠制作视网膜新生血管动物模型。高氧对照组于小鼠生后12天时右眼玻璃体腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)1μg，0.1μg治疗组、0.5μg治疗组、2.5μg治疗组和5μg治疗组分别于小鼠生后12天时右眼玻璃体腔内注射浓度为0.1μg/μl、0.5μg/μl、2.5μg/μl和5μg/μl的Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于术后5天(即出生后17天)观察小鼠视网膜新生血管形成情况，观察项目有： (1) 伊文思蓝视网膜血管造影(每组4眼)：2％伊文思蓝小鼠上腔静脉注射，处死后取眼球固定，分离视网膜进行铺片，荧光显微镜下观察视网膜血管情况并照相； (2) 组织学检查及血管内皮细胞计数(每组6眼)：处死动物摘取眼球，常规组织固定，石蜡包埋，连续组织切片，苏木素．伊红(HE)染色，每隔90μm取一张切片，含视乳头的切片弃去，光镜下观察计数突破内界膜的内皮细胞核，即新生血管内皮细胞，定量分析比较。 2．在视网膜新生血管形成不同时期应用Kringle 1-5根据前述研究得出的最低有效浓度，确定药物剂量为0.1μg。取健康C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、高氧对照组、P12治疗组和P17治疗组。正常对照组于正常大气中饲养，高氧对照组及治疗组制作成高氧诱导的小鼠视网膜新生血管动物模型，P12治疗组于生后12天时右眼玻璃体腔注射0.1，∥g似llKringle 1—5蛋白溶液1μl，P17治疗组于生后17天时右眼玻璃体腔注射0.1μg/μl Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于生后21天时观察小鼠视网膜新生血管形成情况，观察项目同前。 3．Kringle 1-5对视网膜血管内皮细胞凋亡情况影响的检测取健康C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、高氧对照组和P17治疗组，P17治疗组于生后17天时右眼玻璃体腔注射0.1μg/μl Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于生后18、19、20、21天时，取三组小鼠各一只处死，摘除眼球快速冻存，制成冰冻切片。应用TUNEL法原位检测凋亡的细胞，同时应用对血管内皮细胞特异性的免疫荧光标志CD31双染来识别血管内皮细胞，凋亡细胞中有CD31显色的即为凋亡的血管内皮细胞。观察比较各组中凋亡的血管内皮细胞数量。结果一、高氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型所有高氧诱导模型小鼠均出现视网膜新生血管生成反应。视网膜铺片伊文思蓝灌注造影可以清楚、完整的显示小鼠视网膜新生血管模型中视网膜血管无灌注区、血管渗漏、新生血管形成等视网膜血管病变。 正常小鼠在生后15、17、21、24、30天视网膜血管分布均匀，无异常改变。高氧诱导的小鼠视网膜在生后15天出现大量的无灌注区，伴血管迂曲扩张、渗漏、新生血管及微动脉瘤形成，在生后17天时新生血管生成反应达到高峰，生后24天开始退缩，至生后30天时基本恢复正常。 二、Kringle 1-5抑制小鼠视网膜新生血管的实验研究 1．不同浓度的Kringle 1-5对视网膜新生血管形成的影响伊文思蓝灌注造影显示0.1μg、0.5μg、2.5μg和5μg的Kringle 1-5蛋白溶液玻璃体腔注射组小鼠视网膜新生血管显著减少，血管渗漏减轻，无灌注区仍然可见。 石蜡切片HE染色显示，正常对照组、高氧对照组、0.1μg、0.5μg、2.5μg和5μg的Kringlel-5治疗组平均每眼突破内界膜的血管内皮细胞计数分别为0.20±0.15、36.70±21.23、10.80±9.07、9.60±7.41、8.52±7.70和8.71±6.62。各治疗组与高氧对照组、正常对照组之间比较，差异均具有显著性意义(P<0.01)，各治疗组之间差异没有统计学意义(P>0.05)。 2．Kringle 1-5对视网膜新生血管形成不同阶段的作用伊文思蓝灌注造影显示在生后21天时P12治疗组和P17治疗组视网膜新生血管较高氧对照组明显减少，其中以P12治疗组减少更为显著。 石蜡切片HE染色显示，正常对照组、高氧对照组、P12治疗组和P17治疗组在生后21天时平均每眼突破内界膜的血管内皮细胞计数分别为0.09±0.05、19.22±9．85、2.04±1.16、7.88±3.89，各组之间差异具有显著统计学意义(P<0.01)。 3．Kringlel-5对视网膜血管内皮细胞凋亡情况影响的检测在高氧组和Kringle 1-5治疗组均可见到成簇的CD31标记的血管内皮细胞，治疗组与高氧对照组相比凋亡的血管内皮细胞情况未见明显差异。 结论 1．伊文思蓝灌注造影可以清楚的显示高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型视网膜血管形态改变。 2．高氧诱导的C57BL/6J小鼠视网膜新生血管模型，在生后15天时新生血管已经开始形成，并在生后17天时达到高峰，生后24天开始逐渐退缩，生后30天时基本恢复正常。 3．在高氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型中，0.1μg、0.5μg、2.5μg和5μg的Kringlel-5蛋白PBS溶液玻璃体腔注射均能明显抑制视网膜新生血管的形成。 4．新生血管形成初期应用药物作用要优于新生血管形成后再用药。 5．Kringle 1-5蛋白抑制视网膜新生血管形成的作用机制，可能存在除诱导血管内皮细胞凋亡以外的其他途径。