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氟是与人类健康密切相关的一种必需的微量元素,但长期、过量的摄入氟可以引起机体氟中毒,导致组织和器官严重受损,影响人类健康。本试验以猪卵母细胞作为NaF的毒理学模型,研究NaF对卵母细胞的核成熟、细胞质成熟以及印记基因的DNA甲基化模式的影响。主要结果如下:1、分别用0 mM、2 mM、5 mM和10 mM NaF处理卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexs,COCs),发现5 mM和10 mM NaF处理COCs时卵丘颗粒细胞不能扩展,卵母细胞成熟率分别呈显著性和极显著性下降;后续的研究采用5 mM NaF来处理猪卵母细胞。2、对成熟卵母细胞的DNA和α微管蛋白进行免疫荧光染色,发现NaF处理组的正常纺锤体形态的卵母细胞数量与对照组相比显著减少(20.10%vs.56.27%,P<0.05),拖尾纺锤体的卵母细胞数量显著增加(9.53%vs.1.37%,P<0.05),多极纺锤体的卵母细胞数量极显著增加(37.83%vs.0.80%,P<0.01);用FITC标记的花生凝集素标记成熟卵母细胞的皮质颗粒,在激光共聚焦扫描显微镜下评价皮质颗粒分布,发现NaF处理组中皮质颗粒连续分布的卵母细胞数目显著少于对照组(67.20%vs.94.97%,P<0.05),而皮质颗粒残缺不全且不连续分布的卵母细胞数量显著增加(30.73%vs.4.20%,P<0.05)。3、应用JC-1线粒体膜电位测定试剂盒测定卵母细胞的线粒体膜电位,发现NaF处理组和对照组卵母细胞线粒体膜电位无显著性差异(0.94 vs.1.00,P>0.05),表明NaF对卵母细胞线粒体膜电位没有显著性影响。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯(FITC)染色,检测早期凋亡MⅡ卵母细胞,发现NaF处理组凋亡信号比对照组强(校正后的值:1.36 vs.1.00),存在显著性差异(P<0.05)。4、成熟卵母细胞进行孤雌激活和胚胎体外培养时,发现NaF处理组的卵裂率与对照组相比显著增加(90.30%vs.94.89%,P<0.05),但囊胚形成率极显著地降低(11.18%vs.45.63%,P<0.01),表明NaF影响卵母细胞的发育潜力。5、检测印记基因GRB10,IGF2,PEG1,PEG10,H19,NNAT和XIST的mRNA水平,结果显示NaF处理组的卵母细胞中NNAT的转录水平显著降低。通过重亚硫酸盐测序(bisulfite DNA sequencing,BSP)和联合重亚硫酸盐限制分析(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)的方法对NNAT进行甲基化测序分析,发现对照组中95%发生甲基化,未发生甲基化位点为第19个位点,而NaF处理组100%发生甲基化。通过免疫荧光检测NNAT蛋白的水平,发现NaF显著降低NNAT在蛋白质水平的表达。6、为了确定NaF是否影响猪卵母细胞的葡萄糖转运,对NaF处理组的成熟卵母细胞进行2-NBDG荧光染色,发现NaF显著影响卵母细胞的葡萄糖转运能力。向新鲜MⅡ卵母细胞的细胞质中注射NNAT抗体以阻断NNAT的功能,结果表明与注射IgG的对照组相比,注射NNAT抗体的卵母细胞中2-NBDG的荧光强度显著降低,表明NNAT的异常表达影响了卵母细胞的葡萄糖转运。总之,NaF在猪卵母细胞成熟过程中影响卵丘扩张、极体排出、纺锤体形态、皮质颗粒分布、早期凋亡和孤雌激活后的发育。此外,NaF增加了NNAT的DNA甲基化水平,下调了其表达,通过扰乱卵母细胞中葡萄糖的转运能力影响卵母细胞质量。本研究结果为NaF影响卵母细胞成熟提供了新的毒理学机制。