研究背景及目的:目前,放射治疗与外科手术、化学治疗为治疗肿瘤的三大主要手段,并且放射治疗在头颈肿瘤的治疗中有着毋庸置疑的重要地位。对于中国南部以及东南亚地区高发的鼻咽癌来说,放疗已成为首选的治疗手段。然而,头颈部肿瘤的放射治疗仍面临巨大的挑战,即肿瘤细胞的生物学抵抗。肿瘤对辐射的生物学抵抗极大地降低了肿瘤患者的治愈率,是导致肿瘤残留及复发的根本原因。因此,阐明肿瘤辐射抵抗的生物学机制对于最终攻克肿瘤放疗抵抗、延长肿瘤患者生存时间、提高肿瘤患者治愈率具有极重要的临床和社会效益。现有的研究发现,肿瘤细胞所处的局部微环境对于肿瘤的治疗反应有着非常重要的影响。研究显示乏氧区域存在于大多数实体瘤内,其中头颈部肿瘤的乏氧最为常见。肿瘤微环境最突出的一个重要特征是局部乏氧,它赋予了肿瘤细胞特殊的生物学功能,被认为是导致肿瘤放疗抵抗最为关键的因素,也是当前肿瘤生物学领域研究的热点和重点。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)是一种重要的循环内分泌系统,参与调节机体血压、维持体液和电解质稳定。在循环系统中,肾脏分泌肾素进入血液循环,作用于肝脏合成的血管紧张素原(AGT)而生成血管紧张素I(Ang I),后者在血管紧张素转换酶(ACE)的作用下进一步转换为血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)。AngⅡ作为RAS中最重要的生物活性物质,与受体结合产生生物学效应。近十几年来,有研究发现,除循环RAS外,机体多处组织如心脏、脑、肾脏、血管等存在局部RAS,这些组织细胞自身能表达肾素、血管紧张素原、ACE或各种蛋白酶,通过ACE依赖或非ACE依赖的途径产生Ang Ⅱ,以自分泌或旁分泌的方式发挥生物学效应,对组织的生理功能及其结构发挥重要的调节作用。值得注意的是,已有研究表明一些肿瘤组织或者小鼠移植瘤模型中存在Ang Ⅱ。既往的研究发现,Ang Ⅱ能诱导血管内皮生成因子(VEGF)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、乏氧诱导因子1(HIF-1)的表达,参与多种慢性疾病的发生发展。而在肿瘤组织中,这些因子通常与肿瘤的乏氧微环境密切相关,参与肿瘤细胞在乏氧微环境中的重要生物学功能。血管紧张素Ⅱ受体1拮抗剂(AT1R blockers,ARBs)是AT1R的特异性阻滞剂,目前已被广泛应用于多种心血管疾病。1998年发表在Lancet杂志上的一篇回顾性研究报道了首次观察到长期服用ACEI和ARBs的患者中乳腺癌和肺癌的发病率明显降低,且进一步研究发现这种关联性基于特异的RAS拮抗作用而非抗血压效应。有研究显示,AT1R广泛表达于多种肿瘤组织及体外培养的肿瘤细胞中,包括鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌等,并且AT1R的表达情况与肿瘤的增殖、侵袭、转移及抗凋亡等相关。这就提示我们局部RAS可能与肿瘤的某些生物学特性相关。在多数实体瘤中,根据与血管距离的远近形成了不同的肿瘤微环境区域,依次为常氧-乏氧-坏死区。因此,我们推测Ang Ⅱ可能在肿瘤的乏氧区域发挥着重要作用,并进一步研究了局部RAS在肿瘤乏氧区域的激活机制及与肿瘤辐射抵抗的关系。我们的研究发现,Ang Ⅱ主要存在于肿瘤的乏氧区域,并且是由肿瘤细胞通过糜蛋白酶(chymase,CMA)依赖的途径产生,而不是ACE依赖的经典RAS途径。并进一步揭示了糜蛋白酶依赖途径受到糖酵解代谢产物——乳酸水平调节,而且在乏氧肿瘤细胞中Ang Ⅱ水平的增加对于HIF-1α在细胞内的累积起重要作用,并介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗。这不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论依据,而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗从而减少放疗后残留及复发提供了新的思路和手段。方法:1.检测头颈部肿瘤中血管紧张素Ⅱ在肿瘤乏氧区域的表达运用ELISA实验及细胞免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞株和乳腺癌细胞株在.体外不同氧环境(常氧及乏氧)下的血管紧张素Ⅱ表达情况。构建裸鼠皮下移植瘤模型,结合HIF-1α抗体,利用免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ在肿瘤组织中的分布与HIF-1α表达区域的相关性,进而分析Ang Ⅱ与肿瘤乏氧区域的相关性。利用免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ在人鼻咽癌标本中的分布与HIF-1α表达区的相关性,进而分析Ang Ⅱ与肿瘤乏氧区域的相关性。2.检测乏氧情况下肿瘤细胞产生血管紧张素Ⅱ的机制利用AGT慢病毒载体构建稳定抑制血管紧张素原表达的鼻咽癌细胞株CNE2和5-8F,并运用ELISA实验检测鼻咽癌细胞培养基中Ang Ⅱ的表达。通过皮下注射上述细胞株建立小鼠移植瘤模型,运用免疫荧光技术分析移植瘤组织内Ang Ⅱ与哌莫硝唑标记的肿瘤乏氧区域的相关性。通过荧光定量PCR及Western Blot技术检测乏氧肿瘤细胞中血管紧张素原(AGT)、肾素(Renin)和血管紧张素转换酶(ACE)的基因及蛋白的表达水平。针对RENIN和ACE各设计3条短干扰RNA片段(siRNA),使用细胞转染技术抑制细胞中RENIN和ACE的表达。然后利用ELISA实验检测不同氧环境(常氧及乏氧)下鼻咽癌细胞株RENIN和ACE沉默后Ang Ⅱ的表达情况。利用基因表达微阵列分析的方法找出显著影响肿瘤细胞Ang Ⅱ形成的糜蛋白酶(chymase,CMA),并使用Western Blot进一步证实。然后通过构建CMA的慢病毒载体抑制其表达,使用ELISA实验检测不同氧环境(常氧及乏氧)下鼻咽癌细胞株CMA沉默后的Ang Ⅱ表达情况。3.检测改变培养基pH或加入乳酸是否影响肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的表达通过使用1%盐酸(HC1)和5%碳酸氢钠(NaHCO3)将常氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至乏氧条件培养的水平,或者将乏氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平,然后使用ELISA实验检测pH调整后肿瘤细胞培基中Ang Ⅱ表达情况。使用乳酸检测试剂盒检测不同氧环境下(常氧及乏氧)鼻咽癌细胞中乳酸的表达情况,并运用ELISA的实验方法检测不同氧环境(常氧及乏氧)的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后鼻咽癌细胞的Ang Ⅱ表达情况。4.检测肿瘤细胞产生的乳酸是否影响糜蛋白酶的表达运用Western Blot检测不同氧环境(常氧及乏氧)的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后鼻咽癌细胞中糜蛋白酶(chymase,CMA)及肾素(Renin)的蛋白表达水平。通过利用1%盐酸(HC1)和5%碳酸氢钠(NaHC03)将常氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至乏氧条件培养的水平,或者将乏氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平,,使用Western Blot检测上述实验条件下肿瘤细胞中糜蛋白酶及肾素的蛋白表达水平。5.检测乏氧肿瘤细胞中血管紧张素Ⅱ与HIF-1α表达的关系应用Western Blot检测常氧条件下外源性加入人重组血管紧张素Ⅱ及乏氧培养条件下后鼻咽癌细胞中HIF-1α的蛋白表达水平。运用同样的实验方法,检测不同氧环境(常氧及乏氧)下加入坎地沙坦后鼻咽癌细胞株中HIF-1α的蛋白表达水平差异。然后利用AGT慢病毒载体构建稳定抑制血管紧张素原表达的鼻咽癌细胞株,通过皮下注射上述细胞株建立裸鼠移植瘤模型,运用免疫荧光技术分析动物体内Ang Ⅱ与肿瘤乏氧区域HIF-1α表达的相关性。6.检测血管紧张素Ⅱ与头颈部肿瘤细胞辐射敏感性关系利用克隆形成实验检测Ang Ⅱ和乏氧对体外培养的肿瘤细胞辐射敏感性的影响,且观察添加AT1R的特异性阻滞剂坎地沙坦后对乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗的影响。在裸鼠大腿皮下构建鼻咽癌CNE2细胞的移植瘤模型,观察坎地沙坦对动物体内肿瘤辐射敏感性的影响。在裸鼠大腿皮下构建AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的移植瘤模型,观察阻断局部RAS后对小鼠移植瘤辐射敏感性的影响。7.统计分析所有的实验数据均采用均数±标准误的方式呈现,采用SPSS 13.0软件进行统计分析,两样本均数比较采用两独立样本的t检验(Independent-Sample T Test),两组以上样本均数的比较采用完全随机设计资料的方差分析(One-Way ANOVA)。P值<0.05认为有统计学意义。结果:1.肿瘤乏氧区域存在局部血管紧张素Ⅱ利用ELISA试剂盒检测鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、5-8F及乳腺癌细胞株MDA-MB-231不同氧浓度下的Ang Ⅱ生成情况。结果显示在体外普通培养条件(常氧)下,肿瘤细胞培养基中可检测到少量Ang Ⅱ生成,而在乏氧培养条件下,肿瘤细胞培养基中Ang Ⅱ水平显著升高。运用细胞免疫荧光技术检测发现常氧条件下培养的CNE2及MDA-MB-231仅有极少量的Ang Ⅱ表达在胞浆中,而乏氧条件下培养的肿瘤细胞胞浆中Ang Ⅱ表达明显升高。在裸鼠的CNE2移植瘤模型中的荧光检测发现Ang Ⅱ主要集中在乏氧诱导因子HIF-1α高表达的乏氧区域。另外我们还收集了 13例鼻咽癌肿瘤标本,用激光共聚焦显微镜观察到Ang Ⅱ与HIF-1α表达于鼻咽癌肿瘤标本的同一区域。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型中,我们通过组织免疫荧光检测发现在哌莫硝唑指示的肿瘤乏氧区域Ang Ⅱ的表达明显下降。这些结果均提示局部RAS存在于肿瘤的乏氧微环境中。2.乏氧肿瘤细胞不是通过经典的RAS途径产生血管紧张素Ⅱ荧光定量PCR及Western Blot技术检测发现在鼻咽癌CNE2细胞株中只有肾素在乏氧条件下其基因及蛋白水平显著升高,而AGT与ACE在乏氧条件下与常氧相比具有相似的表达水平。在特异性敲除肾素的CNE2和5-8F鼻咽癌细胞株中,通过ELISA检测发现乏氧情况下两细胞株培养基中的Ang Ⅱ水平降低。而特异性敲除血管紧张素转换酶的CNE2和5-8F细胞株中则无此种改变。这些结果提示我们,在乏氧的肿瘤细胞中Ang Ⅱ的产生可能并不依赖典型的RAS途径。3.乏氧肿瘤细胞通过糜蛋白酶依赖途径产生血管紧张素Ⅱ基因表达微阵列分析结果显示,在乏氧的CNE2细胞中糜蛋白酶转录显著增加,并通过Western Blot进一步得到了证实。我们利用慢病毒载体,构建了稳定敲除CMA的CNE2和5-8F细胞株。ELISA实验结果显示,乏氧培养环境中的鼻咽癌细胞株在CMA沉默后其Ang Ⅱ表达较常氧情况下显著降低。以上研究结果表明,在肿瘤的乏氧微环境中,糜蛋白酶介导Ang Ⅱ的生成途径可能是ACE依赖Ang Ⅱ生成途径的替代通路。4.肿瘤来源的乳酸介导了乏氧肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的产生运用ELISA检测不同氧环境(常氧及乏氧)中鼻咽癌细胞CNE2及5-8F的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后其Ang Ⅱ的表达水平。结果显示,用HCl酸化培养基后并未显著增加培养基中Ang Ⅱ的含量,相反,利用5%碳酸氢钠(NaHCO3)将乏氧条件下培养的肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平后Ang Ⅱ的含量上升。以上研究结果表明酸性pH并不是影响乏氧肿瘤细胞CMA依赖途径生成Ang Ⅱ的主要因素。而乳酸测定的结果显示,乏氧条件培养的CNE2及5-8F细胞中乳酸水平较常氧条件下显著升高。在CNE2及5-8F细胞的培养基中加入乳酸盐后,ELISA检测发现常氧及乏氧条件下的培养基中Ang Ⅱ水平显著增高,加入草氨酸钠后抑制胞内乳酸生成后Ang Ⅱ水平则降低,而挽救实验可恢复两种培养条件下培养基中的Ang Ⅱ水平。这就说明是乳酸而不是pH的降低引起乏氧肿瘤细胞中Ang Ⅱ水平的增加。5.肿瘤产生的乳酸调节肿瘤细胞中糜蛋白酶的表达Western Blot检测结果显示,无论常氧还是乏氧培养条件,在CNE2细胞培养基中加入乳酸盐后其糜蛋白酶的表达增加,加入草氨酸钠后则发生抑制。在CNE2细胞培养基中加入碳酸氢钠碱化培养基后,两种培养条件下的糜蛋白酶亦有所增加。此外,乳酸盐及培养基的碱化也使肾素的表达一定程度上升高。这些研究结果表明,乏氧肿瘤细胞中乳酸水平的增加可能是造成糜蛋白酶表达升高的重要因素。6.血管紧张素Ⅱ调节乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白的累积Western Blot实验显示,Ang Ⅱ处理及乏氧条件下的CNE2细胞中HIF-1α蛋白显著升高,而加入坎地沙坦后可抑制HIF-1α蛋白的升高。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型中,我们通过组织免疫荧光检测发现AGT沉默后,大大减弱了 HIF-1α蛋白在哌莫硝唑标记的肿瘤乏氧区域中的积累。这些实验结果说明在乏氧肿瘤微环境中Ang Ⅱ参与调节HIF1-α蛋白的累积。7.局部生成血管紧张素Ⅱ介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗克隆形成实验显示,乏氧条件下鼻咽癌CNE2及5-8F细胞的辐射抵抗能力较常氧条件下显著增加,而AT1R特异性拮抗剂坎地沙坦能逆转乏氧条件造成的肿瘤细胞辐射抵抗,显著增加其辐射敏感性。裸鼠的CNE2细胞株皮下成瘤实验发现AT1R拮抗剂坎地沙坦处理组较对照组显著减小了 10Gy辐射后的肿瘤体积。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2及5-8F细胞的动物移植瘤模型中,AGT沉默组小鼠的移植瘤体积在10Gy辐射后较阴性对照组显著降低。这些结果均表明,肿瘤乏氧微环境中Ang Ⅱ的增加介导了肿瘤的辐射抵抗,使用AT1R拮抗剂坎地沙坦可以特异地在乏氧环境下增加肿瘤细胞的辐射敏感性。结论:本研究揭示了局部RAS主要存在于肿瘤的乏氧区域,肿瘤细胞可能主要通过糜蛋白酶(chymase,CMA)依赖的途径产生Ang Ⅱ,而不是ACE依赖的途径,并以自分泌或旁分泌的方式发挥作用。肿瘤细胞来源的乳酸,而非乏氧环境的pH降低,通过激活乏氧肿瘤细胞的肾素及糜蛋白酶的表达引起Ang Ⅱ的生成增加。最后,我们发现Ang Ⅱ可使乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白增加,从而介导了肿瘤细胞的辐射抵抗,而坎地沙坦可以特异的增加乏氧肿瘤细胞的辐射敏感性。我们的研究结果不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论依据,而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗从而减少放疗后残留及复发提供了新的思路和手段。