多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls,PCBs)是目前国际上极为关注的一类持久性有机污染物(persistent organic pollutants,POPs),是一组由氯原子置换联苯分子中的氢原子而形成的氯代芳烃类化合物,早期曾被广泛应用于工业生产的各个领域,后期由于处理不当,使得大量PCBs进入环境中。2001年包括我国在内的127个国家和地区的代表联合签署了旨在严格禁止或限制使用POPs的《关于对某些持续性有机污染物的斯德哥尔摩公约》,将PCBs列为要控制的12类持续性有机污染物之一。苯并(a)芘(benzo(a)pyrene,B(a)P)是第一个被发现的环境致癌物,也是多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)的代表,它具有很高的致癌性。大量研究表明,PCBs和PAHs常共存于多种环境介质和人体生物样本中[1-2],这使得对PCBs和PAHs联合作用时的损伤效应和损伤机制的研究具有较强的实际意义。本文选择了PCB153和PCB126这两种PCBs作为研究对象,它们不但都属于国际公约中要控制的12种POPs中的PCBs家族,而且又分别具有其代表性,论其危害性,PCB153是人体血液和乳汁中检测到的最多的PCB之一,而PCB126是毒性最强的PCB之一;论其诱导代谢酶的模式,PCB153是PB诱导型,而PCB126是3-MC诱导型;论其化学结构,PCB153是非共面结构而PCB126是共面结构。有研究表明,PCB126和PCB153皆能诱导细胞色素P450酶活化[3-5],而细胞色素P450酶在B(a)P等多环芳烃化合物由前致癌物代谢活化为终致癌物的过程中起着关键作用。因此,PCB153和PCB126有可能通过诱导代谢酶的活化从而增强B(a)P对机体的遗传毒性,故我们采用PCBs和B(a)P联合染毒的方式,探讨环境中共存的这两种污染物是否会比单独存在造成更强的损伤,而毒性增强的途径是否归因于PCBs可诱导代谢酶这一特性从而对B(a)P的遗传毒性造成影响。本文通过体外培养来源于人类的代谢酶完全的肝肿瘤细胞株HepG2,采用荧光分光光度法、比色法、胞质分裂阻滞法微核试验(CBMNT)和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测HepG2细胞经PCB153或PCB126预处理48h,再与B(a)P联合染毒24小时后,其Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2、CYP2B以及II相代谢酶GST活性的变化、细胞中微核的生成、芳烃受体(Ah受体)mRNA表达的改变,探讨PCB126和PCB153对B(a)P致HepG2细胞遗传损伤的影响及其代谢酶机制,并通过加入P450酶抑制剂α-萘黄酮(ANF),验证在PCBs和B(a)P联合染毒的情况下,Ⅰ相代谢酶对遗传毒性变化所起的作用。本文由三部分组成:第一部分:PCB153和B(a)P联合作用致代谢酶改变对HepG2细胞遗传毒性的影响设PCB153四个浓度组(0.1、1、10和100μmol/L),B(a)P 50μmol/L浓度组,DMSO(10ml/L)为溶剂对照。对靶细胞HepG2经PCB153和B(a)P单独染毒和PCB153处理48小时后再与B(a)P联合染毒24小时,检测各处理组HepG2细胞CYP1A1标志酶EROD活性、CYP1A2标志酶MROD活性、CYP2B标志酶PROD活性、GST活性、微核(MN)率和核分裂指数(NDI)。并且加入Ⅰ相代谢酶抑制剂ANF后再次测定以上指标,结果显示:(一)50μmol/L的B(a)P和0.1、1、10和100μmol/L的PCB153均可显著诱导EROD活性(1.05±0.05、0.81±0.02、0.87±0.03、1.10±0.09和1.38±0.14 pmol/min/mg protein),与DMSO溶剂对照(0.72±0.03pmol/min/mg protein)相比,差异具有统计学意义(P<0.01);同样浓度的B(a)P和PCB153也可使MROD活性(1.01±0.05、2.44±0.07、2.81±0.09、3.34±0.14和3.80±0.30pmol/min/mg protein)显著增高,与DMSO溶剂对照(0.83±0.03pmol/min/mg protein)相比,差异具有统计学意义(P<0.01);同样浓度的B(a)P和PCB153对PROD活性(1.48±0.09、1.65±0.06、2.51±0.20、2.77±0.31和3.67±0.31pmol/min/mg protein)也表现出增强效应,与DMSO溶剂对照(1.08±0.04pmol/min/mg protein)相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。50μmol/L的B(a)P可使GST活性增加(2.14±0.06),而0.1、1、10和100μmol/L的PCB153可抑制GST的活性(0.85±0.18、0.70±0.05、0.65±0.10和0.29±0.14U/mgprot),与DMSO溶剂对照(1.09±0.13U/mgprot)相比,差异皆具有统计学意义(P<0.05)。在PCB153和B(a)P联合作用的试验条件下,即经PCB153(0.1、1、10和100μmol/L)预处理再与B(a)P(50μmol/L)联合染毒后,代谢酶活性改变如下:①EROD值分别达1.27±0.01、1.39±0.06、1.47±0.08和1.85±0.06pmol/min/mg protein,较B(a)P单独作用升高了22%、34%、42%和80%,差异具有显著性(P<0.01)。析因设计的多变量方差分析表明二者联合作用对EROD酶的诱导呈现出协同效应;②MROD值分别为3.10±0.08、3.33±0.06、3.44±0.01和3.58±0.06 pmol/min/mg protein,较B(a)P单独作用升高了209%、232%、243%和357%,且差异具有显著性(P<0.001)。析因设计的多变量方差分析表明二者联合作用对MROD酶的诱导在低浓度时呈现协同效应而在高浓度时呈现拮抗效应;③PROD值分别为1.64±0.24、2.45±0.07、2.61±0.27和3.66±0.32pmol/min/mg protein,较B(a)P单独作用升高了16%、80%、113%和218%,差异具有显著性(P<0.01)。析因设计的多变量方差分析表明二者的交互作用无意义。④GST值分别为2.12±0.19、1.73±0.06、1.66±0.09和0.56±0.06U/mgprot,较B(a)P单独作用降低了2%、41%、48%和158%,且差异具有显著性(P<0.01),析因设计的多变量方差分析表明二者联合作用对GST的活性呈现出拮抗效应。ANF对PCB153单独作用以及PCB153与B(a)P联合作用所诱导的EROD、MROD和PROD的酶活性增加表现出抑制,对GST则表现出酶活性诱导增加。(二)50μmol/L的B(a)P和0.1、1、10和100μmol/L的PCB153诱导的HepG2细胞微核率分别为52±6.00‰、27±1.15‰、26±2.00‰、29±4.16‰和49±4.04‰,与DMSO溶剂对照(23±3.05‰)相比,除50μmol/L的B(a)P和100μmol/L的PCB153能显著诱导微核率增加外,其余浓度的PCB153均无增加MN的作用;PCB153对NDI也均无显著影响;经各浓度的PCB153预处理再与50μmol/L的B(a)P联合染毒后,其微核率分别为55±10.07‰、71±6.11‰、76±4.73‰和83±8.00‰,较B(a)P单独作用增高了3%、19%、24%和31%,除0.1μmol/L的PCB153外,其余浓度的PCB153与B(a)P联合作用均较B(a)P单独作用的微核率明显增(P<0.05)。析因设计的方差分析表明PCB153与B(a)P联合作用时,对MN的诱导主要表现为协同效应。加入ANF后,联合作用下的微核率增加得到明显的抑制,但在最高浓度的PCB153和B(a)P联合作用条件下,微核率仍保持较高水平。综上所述,PCB153和B(a)P在一定剂量水平上均能诱导HepG2细胞Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2、CYP2B活性的增加,二者联合作用对Ⅰ相代谢酶活性升高具有一定的协同效应;PCB153能抑制Ⅱ相代谢酶GST的活性,PCB153和B(a)P联合作用对GST的诱导呈现拮抗效应;除最高浓度外,其余浓度的PCB153对HepG2细胞MN的生成无显著影响,PCB153和B(a)P联合作用则对MN的诱导呈现协同效应。加入ANF后对Ⅰ相代谢酶的抑制和对Ⅱ相代谢酶的增强,以及对微核率的抑制,验证了在PCB153和B(a)P联合作用的模式下,B(a)P被代谢活化遗传毒性得以增强的过程中,PCB153对代谢酶所起的关键性调控作用。第二部分:PCB126和B(a)P联合作用致代谢酶改变对HepG2细胞遗传毒性的影响设PCB126四个浓度组(0.01、0.1、1、10nmol/L),B(a)P 50μmol/L浓度组,DMSO(10ml/L)为溶剂对照。对靶细胞HepG2经PCB126和B(a)P单独染毒和PCB126处理48小时后再与B(a)P联合染毒24小时,检测各处理组HepG2细胞CYP1A1标志酶EROD活性、CYP1A2标志酶MROD活性、CYP2B标志酶PROD活性、GST活性、微核率和NDI。并且加入Ⅰ相代谢酶抑制剂ANF后再次测定以上指标,结果显示:(一)50μmol/L的B(a)P和0.01、0.1、1、10nmol/L的PCB126均可引起EROD活性(1.05±0.05、1.14±0.20、1.50±0.28、1.63±0.25和2.10±0.14pmol/min/mg protein)显著增高,与DMSO溶剂对照(0.72±0.03pmol/min/mg protein)相比,差异具有统计学意义(P<0.01);同样浓度的B(a)P和PCB126也可引起MROD活性(1.01±0.05、2.66±0.35、2.84±0.12、3.12±0.07和3.17±0.04pmol/min/mg protein)增强,与DMSO溶剂对照(0.83±0.03pmol/min/mg protein)相比,差异具有统计学意义(P<0.05);B(a)P和PCB126(0.01μmol/L浓度除外)还可引起PROD活性(1.48±0.09、1.01±0.35、1.59±0.22、1.66±0.17和1.95±0.11pmol/min/mg protein)增强,与DMSO溶剂对照(1.08±0.04pmol/min/mg protein)相比,差异皆有统计学意义(P<0.05);50μmol/L的B(a)P使GST活性增加(2.14±0.06U/mgprot),而各浓度的PCB126可抑制GST的活性(1.11±0.15、0.29±0.04、0.26±0.02、0.25±0.02和0.24±0.12U/mgprot),与DMSO溶剂对照(0.83±0.13U/mgprot)相比,差异皆具有统计学意义(P<0.05)。经PCB126与B(a)P联合染毒,即经PCB126(0.01、0.1、1、10nmol/L)预处理再与B(a)P(50μmol/L)联合染毒后其代谢酶活性变化如下:①EROD值分别为1.89±0.01、1.90±0.09、1.96±0.07和1.99±0.18pmol/min/mg protein,与B(a)P单独作用升高了117%、189%、195%和198%,差异具有显著性(P<0.001),析因设计的多变量方差分析表明二者联合作用对EROD的诱导主要呈现协同效应,仅在PCB126达最高浓度时,二者联合作用显示出拮抗效应;②MROD值分别为3.15±0.32、3.43±0.24、3.46±0.05和3.84±0.03pmol/min/mg protein,较B(a)P单独作用升高了214%、342%、345%和383%,且差异具有显著性(P<0.001),析因设计的多变量方差分析表明二者联合作用对MROD酶的诱导呈现出协同效应;③PROD值分别为0.45±0.04、1.12±0.10、2.19±0.18和2.25±0.07pmol/min/mg protein,与B(a)P单独作用比较,PCB126在低浓度时与B(a)P联合作用使PROD活性降低,而在PCB126较高浓度时,二者联合作用可使PROD活性升高71%和117%,且差异具有显著性(P<0.01),析因设计的多变量方差分析表明二者联合作用对PROD酶的诱导主要呈现出拮抗效应;④GST值分别为1.11±0.17、0.99±0.11、0.85±0.08和0.71±0.11U/mgprot,较B(a)P单独作用降低了1%、13%、26%和40%,PCB126在较高浓度时与B(a)P联合作用引起的GST活性降低具有统计学意义(P<0.05),析因设计的多变量方差分析表明二者联合作用对GST酶的交互作用主要呈现协同效应。ANF对PCB126单独作用以及PCB126与B(a)P联合作用诱导的EROD、MROD和PROD的酶活性增加表现出抑制,对GST则表现出酶活性诱导增加。(二)50μmol/L的B(a)P和0.01、0.1、1、10nmol/L的PCB126诱导的HepG2细胞微核率分别为52±6.00‰、22±8.14‰、30±10.5‰、35±7.76‰和36±6.50‰,与DMSO溶剂对照(23±3.05‰)相比,除B(a)P能显著诱导微核率增加外,其余浓度的PCB126均无诱导MN增加的作用,对NDI也无显著影响;经0.01、0.1、1、10nmol/L的PCB126预处理再与B(a)P联合染毒后,其微核率分别为52±4.51‰、73±5.51‰、79±4.24‰和86±2.00‰,后三者较B(a)P单独作用诱导的MN(52±6.00‰)增高了21%、27%和34%,且差异有显著性意义(P<0.05)。析因设计的方差分析表明PCB126与B(a)P联合作用时,其交互作用主要表现为协同效应。加入ANF后联合作用组的微核率得到了明显的抑制。综上所述,PCB126和B(a)P在一定剂量水平上均能诱导HepG2细胞Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2、CYP2B活性的增加,PCB126则能抑制Ⅱ相代谢酶GST的活性。PCB126与B(a)P联合作用对代谢酶的影响,因PCB126的浓度而呈现多样化,总趋势是:对CYP1A1、CYP1A2和GST的影响主要表现为协同效应,对CYP2B的影响主要表现为拮抗效应。受试浓度下的PCB126无诱导微核率增高的作用,PCB126与B(a)P联合作用对MN的诱导呈现出协同效应。加入抑制剂ANF后抑制了Ⅰ相代谢酶的活性,增强了Ⅱ相代谢酶的活性,并使微核率下降,验证了在PCB126和B(a)P联合作用的模式下,B(a)P被代谢活化遗传毒性得以增强的过程中,PCB126对代谢酶所起的关键性调控作用。由于PCB126是Ah受体高亲和力的配体,它可通过影响Ah受体而改变Ⅰ相代谢酶酶活性,以下第三部分以PCB126和B(a)P联合作用时Ah受体的mRNA的改变为切入点,进一步探讨二者在联合作用时B(a)P遗传损伤增强的途径。第三部分:PCB126和B(a)P联合作用对HepG2细胞Ah受体基因表达的影响设PCB126四个浓度组(0.01、0.1、1、10nmol/L),B(a)P 50μmol/L浓度组,DMSO(10ml/L)为溶剂对照。采用对靶细胞HepG2经PCB126处理48小时后再联合染毒B(a)P 24小时的方式,运用RT-PCR法检测各处理组HepG2细胞Ah受体mRNA表达的变化。结果显示B(a)P处理组和PCB126四个浓度的Ah受体的mRNA光密度比值明显增高,分别为0.111±0.018、0.258±0.036、0.416±0.068、0.717±0.041和0.929±0.060,与DMSO溶剂对照(0.015±0.004)相比,皆有统计学意义(P<0.001);经各浓度PCB126与B(a)P联合染毒后,Ah受体的mRNA光密度比值分别为0.424±0.011、0.616±0.033、0.832±0.040和0.886±0.007,较B(a)P单独作用增高了31%、51%、72%和78%,差异具有显著性(P<0.001)。加入ANF后Ah受体mRNA表达明显下降,与DMSO溶剂对照相比差异无统计学意义。Pearson相关分析发现,PCB126与B(a)P联合作用时CYP1A1和CYP1A2的活性与Ah受体mRNA的表达呈正相关,相关系数分别为0.838(P<0.01)和0.900(P<0.01);而Ah受体mRNA的表达与微核率也呈现正相关,其相关系数为0.899(P<0.01),故可推测由Ah受体介导的Ⅰ相代谢酶活性增高对微核率的增加有明显的影响,提示Ah受体在PCB126和B(a)P联合作用产生的协同效应中不可替代的作用。综上所述,PCB126和B(a)P在一定剂量水平上均能诱导HepG2细胞Ah受体mRNA的表达增加,二者联合作用对Ah受体的诱导主要表现为协同效应。由于PCB126属3-MC代谢酶诱导类型,Ah受体通路是其诱导代谢酶的主要通路,作为Ah受体高亲力的配体,PCB126能通过影响Ah受体增加Ⅰ相代谢酶的活性从而增强B(a)P的遗传毒性。本文主要结论和创新点:主要结论:1.PCBs能诱导Ⅰ相代谢酶,抑制Ⅱ相代谢酶,通过改变代谢酶的活性,使B(a)P的遗传毒性明显增强;2.作为非共面结构的PCB,PCB153对B(a)P遗传毒性增强的具体机制虽然还不是很清楚,但显而易见与Ⅰ、Ⅱ相代谢酶活性的改变有很重要的关系;3.作为共面结构的PCB,PCB126对B(a)P遗传毒性的增强主要是通过与Ah受体结合,促进Ⅰ相代谢酶合成增加的途径而实现,证实了Ⅰ相代谢酶在PCBs对B(a)P遗传毒性起协同效应时的关键作用。创新点:1.首次将两种有代表性的PCBs和B(a)P在哺乳动物细胞中进行联合染毒从而建立了PCBs-PAH联合作用的模型,证实了PCBs可通过改变Ⅰ、Ⅱ相代谢酶的活性从而使B(a)P的遗传毒性得到增强,为进一步揭示POPs联合暴露对机体健康的影响提供了科学依据;2.首次发现PCB153和PCB126在一定的剂量范围内可抑制GST的活性,为今后探讨PCBs对Ⅱ相代谢酶影响的研究提供了理论依据。