丁酸钠对人肝癌细胞凋亡诱导作用的研究

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目的:通过观察NaB对人肝癌SMMC-7721细胞抑制增殖、诱导凋亡的作用,探讨在一定时间范围内,NaB诱导体外培养的人肝癌细胞凋亡的最适作用浓度。分析p21WAF1基因在NaB诱导人肝癌细胞凋亡过程中的变化规律及其与体外培养的肝癌细胞凋亡的相关性,初步探讨NaB诱导人肝癌细胞凋亡的作用机制。 方法:人肝癌SMMC-7721细胞用含10%小牛血清的1640培养基置37℃、5%CO2孵箱培养。细胞分实验组和对照组,传代时分别加入丁酸钠和等体积的PBS。实验组采用华罗庚优选法确定实验浓度分别为0.10、0.65、1.00、1.70、2.15、2.85、4.00、7.70、10.00mmol/L,将不同浓度NaB以不同时间作用于人肝癌细胞,采用MTT比色法、倒置显微镜观察细胞增殖抑制并绘制细胞增殖抑制曲线,所得结果进行相关分析;荧光显微镜、透射电镜(TEM)观察细胞凋亡的形态变化;流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率和细胞周期;半定量RT-PCR方法检测细胞p21WAF1基因mRNA的表达水平;Westem-blot检测细胞p21WAF1蛋白的表达变化。 结果:NaB对人肝癌细胞生长的抑制呈剂量依赖和时间依赖关系。常规倒置显微镜下,经低浓度NaB处理的细胞24后出现胞体显著增大,细胞形态变圆,折光度差,胞浆内出现营养不良性颗粒。高浓度NaB处理的细胞12h后迅速出现细胞坏死,表现为细胞自培养瓶脱落,细胞萎缩、狭长,细胞间界线不清,胞浆内出现大量营养不良性颗粒。经中浓度NaB处理的细胞,细胞12h后胞体略增大,胞浆内出现营养不良性颗粒,维持培养5天后细胞开始坏死并逐步脱落。透射电镜及荧光显微镜观察到细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂以及凋亡小体形成等凋亡形态学改变。FCM分析细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期,S期比例明显减少,细胞增殖指数明显下降。半定量RT-PCR方法测定人肝癌细胞p21WAF1 mRNA的表达水平较对照组明显增加。Western-blot方法检测人肝癌细胞p21WAF1蛋白的表达在实验组亦同步增加。p21WAF1 mRNA和蛋白的增加与人肝癌细胞凋亡过程基本一致。 结论:NaB具有抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖、诱导其凋亡的作用,这种作用呈剂量依赖和时间依赖关系。NaB抑制人肝癌细胞增殖、诱导其凋亡的作用与诱导细胞高表达p21WAF1蛋白有关。体外培养5天表明,NaB诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的最适作用浓度为2.85mmol/L。
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