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温敏核不育水稻在两系法水稻育种中有不可替代的地位,水稻雄性不育的相关研究是水稻育种工作者的一大热点方向。温敏核不育水稻的育性性状随外界温度变化而改变。当其处于幼穗分化的敏感时期,外界温度高于临界温度时,表现出不育性状;外界温度低于临界温度时,表现出可育性状。不育系HD9802S具有转育起点温度低,育性稳定（日均温23℃以下处理5天以上才会转育）等优点。以HD9802S为母本、固优12为父本杂交选育的HD9802-7S和HD9802-9S两个品系的转育起始温度高于HD9802S。我们预测这两个品系中存在与HD9802S有差异的微效基因调控它们的育性。本实验室在前期的研究中,用SSR分子标记等技术对HD9802S的不育基因定位,关注到位于2号染色体上的Os02g0221300基因和Os02g0221400基因。通过BSA重测序发现这一基因位于2号染色体上调控HD9802S育性的主效基因tms5附近。设计Os02g0221300基因干扰载体转化93-11,转化株全部表现可育性状,T1代分离出表现为不育性状的93-11子代。预测这一基因与水稻育性调控相关联。我们对此做出了研究,具体研究结果如下:1、构建HD9802-9S/R446F2群体、HD9802-9S/R144F2群体和广占63-4S/R66F2群体,群体大小为1000株。每个群体中随机选择100个不育单株和100个高度可育单株。分别抽提水稻基因组DNA构建三个群体的极端混池,共6个,和HD9802-9S、R446、R144、R66和广占63-4S五个亲本池,并对11个混池进行BSA重测序。2、BSA重测序结果显示,HD9802-9S/R446F2群体和HD9802-9S/R144F2群体的BSA重测序结果相同。当置信水平为95%时,与HD9802-9S不育性状相关的SNP突变定位于2号染色体的4590000～10180000区间和7号染色体的20540000～21240000区间。覆盖HD9802-9S 2号染色体上84个候选基因和7号染色体上4个候选基因。与广占63-4S不育性状相关的基因定位于2号染色体1840000～19480000区间内,覆盖广占63-4S 2号染色体上396个候选基因。当置信水平为99%时,与HD9802-9S不育性状相关的SNP突变定位于2号染色体的5130000～9950000区间和7号染色体的20580000～20730000区间。覆盖HD9802-9S 2号染色体上64个候选基因,7号染色体上没有候选基因。与广占63-4S不育性状相关的SNP突变定位于2号染色体1970000～19270000区间。覆盖广占63-4S 2号染色体上375个候选基因。3、在基因Os02g0221300的第一号外显子上设计两个靶位点,构建一个Os02g0221300 CRISPR-CAS9双靶点载体。分别转化粳稻日本晴和籼稻93-11,获得了29株日本晴阳性株,9株93-11阳性株。对所有阳性转化株的花粉育性进行镜检鉴定并统计,结果显示日本晴和93-11阳性株的花粉育性受到影响。对29株日本晴转化株产生的花粉鉴定并统计,其花粉可育率为0-80%,其中编号为12号和27号阳性株花粉可育率为0。12号阳性株的靶位点序列发生杂合突变,其第一靶位点的两条同源染色体突变为一条带缺失3个碱基,一条带66-89位缺失24个碱基;第二靶位点的两条同源染色体一条带缺失13个碱基,另一条带18bp片段被一个5bp片段替换。27号阳性株的靶位点序列发生杂合突变,一条同源染色体发生大片段缺失,另一条染色体为复杂突变测序结果无法解码。对日本晴转化株考种时发现,日本晴单株出现半不育或者不育。对3株93-11转化株的花粉育性鉴定并统计,其中两株的花粉可育率为60%左右,一株的花粉可与率在95%以上。对所有93-11转化株考种时发现,编号为6号和8号的阳性株表现为不育性状。其中6号阳性株靶位点为杂合突变,一条同源染色体发生大片段缺失,另一条同源染色体复杂突变测序结果无法解码。8号阳性株为纯合突变,靶序列发生180 bp的大片段缺失。编号为3的阳性株表现半不育（跳籽）性状,为杂合突变,一条同源染色体第一靶位点缺失3个碱基;第二靶位点复杂突变无法解码,另一条同源染色体发生大片段缺失。4、Os02g0221400基因是一个RNA基因,在基因5’端和3’端各有一个转录本,能够转录出一段长链非编码RNA。在Os02g0221400基因的5’端转录本上设计一段长为433bp的干扰片段构建Os02g0221400RNAi载体。分别转化籼稻93-11、粳稻日本晴和不育系HD9802S,获得了17株HD9802S阳性株;10株93-11阳性株和13株日本晴阳性株。对Os02g0221400RNAi载体阳性转化株的花粉育性鉴定及统计时发现,Os02g0221400基因的表达被干扰,日本晴和93-11的花粉可育率降低。对13株日本晴阳性株产生的花粉镜检,其花粉数量少且多为不育花粉,结实率由野生型的86.5%降低至20%～80%。对四株93-11转化株花粉镜检并统计发现其花粉可育率为45%～75%。在对所有93-11转化株考种时发现,编号为7的阳性株发生轻微跳籽,该阳性株的Os02g0221400基因表达量为93-11野生型的0.42229倍。编号为8、9、10的阳性株表现不育性状,其Os02g0221400基因的表达量分别为93-11野生型的0.44290倍,0.17184倍和0.13504倍。HD9802S转化株移栽至海南生长。由于HD9802S阳性株生长发育时期海南日均温持续高于HD9802S转育临界温度,所以HD9802S的阳性转化株都表现不育性状。