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PRRSV NADC30-Like毒株是近5年开始流行的毒株,部分地区尚未引起重视,已在国内多地造成较大经济损失,故深入研究该类毒株病原特性与检测方法对于防控PRRSV具有重要意义。随着养猪业贸易国际化,养猪业正处于空前发展时期,亦使得该病的防控难度增加。本研究自四川地区送检病料中分离出一株PRRSV NADC30-Like毒株,对分离株进行部分生物学特性研究和生物信息学分析。同时建立了NADC30-Like SYBR Green I qPCR检测方法。并以分离株为基础,建立IPMA和基于重组N蛋白间接ELISA的两种抗体检测方法。本研究旨在了解分离株部分生物学特性基础上,研究其重组演化与免疫的关系,进而完善PRRSV检测方法,最终为准确可靠诊断出NADC30-Like毒株奠定基础,同时为更好地防控PRRSV提供科学参考。1.NADC30-Like PRRSV SYBR Green I qPCR检测方法的建立与初步应用为更加快捷准确的鉴别诊断出NADC30-Like PRRSV病原,本研究建立了SYBR Green I qPCR检测方法,设计该类毒株保守的特异性引物,制备其标准品,建立标准曲线方程:Ct=-3.143 lg（copies）+43.032,拷贝数与Ct值具有良好的线性关系,R2=0.975,扩增效率为108.1%,组内变异系数小于1.6%,灵敏度可达8.85×102copies/μL。该方法检测灵敏度、特异性较高,具有良好的应用价值。2.毒株分离鉴定及其部分生物学特性与生物信息学分析本研究对上述阳性样本进行筛查确保无其它病原,开展病毒分离工作,以上述方法检测与IFA进行鉴定,确定为PRRSV,与常见的PRRSV毒株相比,分离株在分离前期不产生明显CPE,后期出现CPE,测定其滴度为10-4.17 TCID50/0.1 mL;生物信息学分析显示其为PRRSV NADC30-Like毒株,命名为CJS01株。通过对毒株在Marc-145细胞上增殖过程中核酸载量的测定,表明病毒在细胞上适应性良好,病毒在细胞上增殖到84 h核酸载量最高;通过对ORF37基因的重组分析及其抗原表位预测,发现CJS01株引起畜体产生中和抗体和亚中和抗体的两个重要核苷酸位点均在此重组区间,可能致使免疫形势更为复杂。3.PRRSV NADC30-like毒株IPMA方法的建立由于NADC30-Like PRRSV作为新型PRRSV毒株,尚需对其产生抗体方面深入研究。IPMA检测方法在对抗体产生时间与种类等方面有诸多优势。本研究在分离株CJS01的基础上建立一种IPMA检测方法,优化其初始细胞接种剂量、最佳孵育时间与二抗浓度分别为病毒液(10-4.17 TCID50/0.1mL)接种量10倍稀释;HRP-SPA的二抗按1∶3000的倍数、血清以1∶30的倍数进行稀释。结果表明该方法特异性高而敏感性低,有应用于探索新毒株抗体产生相关研究的潜力。4.基于重组N蛋白间接ELISA方法的建立与初步应用为适应临床大量样本的检测,本研究通过构建PRRSV NADC30-Like毒株N基因的重组蛋白质粒pET32a-N,通过SDS-PAGE电泳鉴定目标蛋白为可溶性蛋白;Western blotting与间接ELISA方法验证结果表明蛋白具有良好的反应原性;对表达条件进行了一系列优化,表明在37℃,IPTG终浓度为0.2 mmol/L诱导表达2 h为最佳表达条件。以表达的重组N蛋白为包被原,当其抗原包被的浓度为10μg/mL,待测血清以40倍稀释、使用二抗稀释3000倍时进行反应,此条件下效果理想,可较好进行临床样品的检测,具有良好的特异性和稳定性。