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新城疫(Newcastle disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus)引起的鸡和多种禽类的急性,高度接触性传染病。世界卫生组织将其为A类动物疫病,该病危害世界养禽业最严重的传染病之一,由于其传播速度快,给养禽业带来了巨大的经济损失,尤其是养鸡业,因此,预防、控制该病是我国目前以及今后相当长的一段时间内面临的一项艰巨任务,因此对于新城疫病毒诊断试剂合的研究具有重要的意义。为了建立新城疫病毒检测方法,我们首先要制备抗新城疫病毒单克隆抗体。本研究首先把NDV超离纯化的全病毒抗原免疫6—8周龄BALB/c雌性小鼠,基础免疫和加强免疫之后,采血测定抗体滴度。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%PEG作用下融合。分别用全病毒包被ELISA方法,血凝抑制试验(HI)和间接免疫荧光法(IFA)筛选阳性细胞,阳性细胞经有限稀释法反复克隆培养,最后获得5株NDV特异性单克隆抗体,分别为1F10、2H3、4E4、5B11、5E9。接着向BALB/c小鼠腹腔接种阳性杂交瘤细胞,1周后采腹水,离心取上清液,各株McAb腹水效价测定显示,NDV特异性McAb效价都符合双抗体夹心ELISA检测方法的建立,此5株单抗都没有血凝抑制效价。这五株杂交瘤细胞分泌的抗体均有良好的热稳定性。腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,蛋白含量为2.65mg/mL—3.71mg/mL之间。特异性试验结果表明,5株McAb中,两株McAb与禽流感病毒(AIV),甲型流感病毒,鸡马立克氏病(MDV)、网状内皮组织增殖症病毒(REV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)以及鸡产蛋下降综合征(EDS—76)均无交叉反应,此结果表明所得的两株单抗是针对NDV特异性单抗。此2株单克隆抗体的获得为新城疫病毒快速检测奠定了基础。本研究在研制出新城疫病毒特异性单克隆抗体的基础上,以单抗2H3作为包被抗体,4E4-辣根过氧化物酶标记(4E4-HRP)作为检测抗体的配对,建立了检测特异性新城疫病毒的双抗体夹心ELISA方法。通过对各步反应条件进行优化,最终获得的最佳工作条件为：单克隆抗体为1：1600倍稀释,HRP酶标记抗体为1:320倍稀释,包被抗体最佳反应条件为4℃过夜,HRP酶标抗体的最佳工作条件为37℃,45min。用建立的双抗体夹心ELISA方法对以知的REV、IBDV、RBV、IBV、EDS—76及AIV等禽类病毒进行了交叉反应性试验,此试验结果表明无交叉反应性。本方法特异性强,灵敏度高,可以用于NDV的快速检测及鉴别诊断。