【研究背景】： 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pae)属于非发酵革兰阴性菌，是人体最常见的条件致病菌之一，它广泛分布于自然界，正常人的皮肤、肠道和呼吸道中，当机体免疫力低下时可引起人体多系统、多脏器或多部位感染，在医院获得性感染中占有非常重要的地位。近年来，由于其分离率高、治疗困难并时有爆发流行而受到高度重视。 亚胺培南是迄今为止开发的抗菌药物中抗菌谱最广、抗菌作用最强的一类碳青霉烯类抗生素，作为治疗铜绿假单胞菌所引起严重感染的最后一道防线。然而，随着碳青霉烯类抗生素的大量临床应用，细菌对其耐药的情况也逐年增多，亚胺培南耐药铜绿假单胞菌在世界范围内均有报道，常常导致在临床上无药可治的地步。其中产金属β-内酰胺酶(Metallo-β-Lactamases，MBL)是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制之一。 金属β-内酰胺酶能高效水解除单环β-内酰胺类以外的所有β-内酰胺类抗生素，介导产MBL菌株对青霉素、头孢菌素、碳青霉烯等多种抗菌药物形成耐药。迄今为止，已有5类金属β-内酰胺酶被相继报道，它们分别是IMP家族、VIM家族、SPM-1、GIM-1和SIM-1。 大多数金属β-内酰胺酶的编码基因位于整合子上。整合子是细菌中的可移动遗传物质，携带位点特异性重组系统组分，可将多种耐药基因盒(gene cassette)整合在一起。细菌通过整合子系统，在整合酶的作用下，可以捕获外来的耐药基因，并在位于整合子上游的启动子的作用下得到表达，从而具有耐药及多重耐药性。现有的文献资料显示，亚胺培南耐药铜绿假单胞菌所引起的爆发性流行在全球范围内均有报道。在亚洲地区，特别是日本和台湾，亚胺培南耐药铜绿假单胞菌引起的院内感染也屡见报道。 【目的】： 1.了解铜绿假单胞菌对常见抗生素的耐药现状及其耐药谱特征，以指导临床合理选用抗生素； 2.明确金属β-内酰胺酶在广州地区铜绿假单胞菌中的流行状况及其流行亚型，完善广州地区金属β-内酰胺酶的分子流行病学资料； 3.研究整合子在广州地区铜绿假单胞菌中的分布情况及其所携带的耐药基因盒，探讨整合子与细菌多重耐药机制之间的相关性。 【方法】： 1.采用VITEK-32型全自动细菌分析系统对临床收集的铜绿假单胞菌进行重新鉴定； 2.依据美国临床和实验室标准化协会(CLSL原名NCCLS)2007年版推荐的纸片扩散法进行药敏试验，并用琼脂稀释法检测铜绿假单胞菌对常见抗生素的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations，MIC)； 3.采用双纸片协同和双纸片增效两种方法筛选金属β-内酰胺酶表型阳性菌株； 4.设计合成针对blaIMP、blaViM、blaGIM-1、blaSPM-1、blaSIM-1和整合子的引物序列，采用PCR技术对产MBL铜绿假单胞菌进行特异性扩增，并对PCR产物进行DNA测序分析。 【结果】： 1.细菌的临床资料显示，499株铜绿假单胞菌主要分离自痰标本(67.9％)，病房分布则集中在ICU(40.8％)和呼吸科(35.0％)；药敏试验结果显示，499株铜绿假单胞菌对下列抗生素的平均耐药率分别为：亚胺培南(32.8％)、美罗培南(21.4％)、头孢他啶(7.1％)、头孢吡肟(8.3％)、庆大霉素(42.0％)、阿米卡星(36.6％)、环丙沙星(7.6％)、左旋氧氟沙星(8.1％)、氨曲南(20.5％)、哌拉西林(8.8％)、哌拉西林／三唑巴坦(83％)，其中，2003年～2007年5年期间铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率分别是27.7％、25.0％、31.6％、35.2％和34.3％： 2.164株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌对抗生素的耐药谱显示，多重耐药菌株占绝大多数(68.9％)，泛耐药菌株占28.6％，且对每种抗生素的耐药率均在50％以上； 3.22株金属β-内酰胺酶表型阳性的铜绿假单胞菌均为多重耐药菌株，其中8株为泛耐药菌株，标本类型以痰标本为主；基因检测结果显示，其中11株产IMP-9型MBL，5株产VIM-2型MBL，4株产生一种新的IMP家族亚型，命名为IMP-25，共有16株铜绿假单胞菌携带I类整合子，另有2株金属β-内酰胺酶和整合子的PCR检测结果均为阴性。 【结论】： 1.2003年～2007年广州地区铜绿假单胞菌整体耐药现象严重，对亚胺培南的耐药率一直维持在较高水平； 2.广州地区铜绿假单胞中金属β-内酰胺酶的基因型已经出现多型化的特征，同时存在IMP型和VIM型金属β-内酰胺酶的流行； 3.发现了一个新的会属β-内酰胺酶亚型(IMP-25)，为IMP家族金属β-内酰胺酶的多样性及其分子流行病学资料提供了新的信息； 4.产MBL铜绿假单胞菌广泛含有I类整合子，整合子参与铜绿假单胞菌对抗生素的多重耐药机制。