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目的1.对两种新型培养基—内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium,ECM)和无动物细胞成分培养基(Animal compound free medium,ACF)在无血清器官培养保存角膜内皮细胞活性方面的效果进行综合评估,对其在无血清角膜培养保存领域的应用前景进行初步探索。2.观察新型人造胶体羟乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch,HES)的最新剂型HES130/0.4对器官培养保存角膜片的脱水效果,并与葡聚糖T500相比较,探讨其成为新型角膜脱水剂的可行性。3.为控制移植术后排斥反应发生,阻止内皮细胞损失,探索腺病毒载体对器官培养法保存的离体兔角膜片上内皮细胞的转染效率,以检测报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的荧光表达来明确腺病毒的转染效率和动态过程。4.建立不同类型器官培养法保存角膜植片的大鼠角膜移植模型,检测移植后数种参与两大类辅助性T细胞因子Th1因子和Th2因子平衡调节作用的细胞因子和T细胞亚群在眼局部和(或)全身的表达,分析其在器官培养保存角膜移植相关免疫排斥反应中的作用。方法1.将兔和大鼠角膜各80只平均分为5组,在5种含或不含胎牛血清(fetal calf serum,FBS)的培养基中(MEM+2%FBS、高糖DMEM+2%FBS、ECM+2%FBS/ECM、ACF)密闭保存3周后,进行角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CEC)计数和活性染色、兔角膜厚度测量、免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)、免疫印迹法(western blotting,WB)和反转录-聚合酶链反应法(reverse transcription polymerase chain reagction,RT-PCR)定性或半定量检测兔角膜内皮层中肌动蛋白微丝(filament actin,F-actin)和大鼠角膜内皮层中紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)的表达来衡量CEC间连接的紧密程度以及透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)下CEC超微结构的观察。2. 18对配对兔角膜片,一半于无血清ACF培养液中保存21d,葡聚糖T500脱水48h作为对照组;另一半于含10%HES 130/0.4的ACF培养液中保存21d作为实验组,不再另外行脱水程序。保存前后进行CEC计数及活性染色、角膜厚度和含水量的测定、角膜透明度和后弹力层皱褶程度的评估、IHC和WB法分别定性和半定量检测兔角膜内皮层中F-actin的表达以及TEM下CEC超微结构的观察。3.去上皮兔角膜片24只随机分为4组,每组6只角膜,在添加2%FBS的ECM培养液中保存2~3周后与编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒载体Ad5(滴度范围5×106 vp/uL～5×109vp/uL)37℃下共同孵育3h进行基因转染,随后31℃下继续器官培养观察角膜2周。检测前剥离大部分植片基质,倒置荧光显微镜下观察不同时间点EGFP在CEC中的表达强度,比较不同滴度组腺病毒载体的转染效率、CEC计数,TEM观察CEC超微结构变化。4.选用Wistar大鼠24只,SD大鼠54只,新西兰大白兔12只。将54只SD大鼠随机分为5组:①为正常角膜组成的对照组,②为新鲜大鼠角膜同种异体穿透性移植组(penetrating keratoplasty,PKP),③为去CEC同种异体大鼠角膜+器官保存兔角膜后弹力层和内皮细胞复合体(DM+CEC)移植组,④为器官培养法保存大鼠角膜同种异体PKP组,⑤为去CEC同基因大鼠角膜+器官保存兔角膜DM+CEC移植组。兔角膜保存时间2~3周不等。②～④组制备Wistar→SD大鼠PKP模型,⑤组制备SD→SD大鼠PKP模型。术后观察各组植片的排斥情况和存活时间,酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)定量检测房水和血清中白细胞介素2(IL-2)、干扰素-gamma(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达,IHC法定性检测术后植片内CD25+ T细胞的表达,RT-PCR半定量检测植片内TNF-α、IFN-γ、IL-4和CD25 mRNA的表达,流式细胞术检测外周血中CD25和CD28亚群的表达。结果1.结果显示,ECM和ACF保存组角膜的ECD最高,细胞超微结构与正常角膜间的区别最小,MEM组的ECD值则最低,降幅最大,细胞器等超微结构破坏较严重。F-actin和ZO-1在各组兔和大鼠角膜内皮层都有表达。WB显示F-actin蛋白在ECM和ACF组表达水平最高,DMEM组次之,MEM组最低, RT-PCR法证实ZO-1 mRNA在各组的表达趋势与兔F-actin的结果一致。2.保存结束时含10%HES130/0.4的实验组植片较薄,但ECD值略低于对照组。对照组经葡聚糖T500脱水后,厚度和透明度与实验组差别变小,但ECD值明显降低。IHC和WB证实F-actin蛋白在两组内皮层都表达,实验组表达水平高于对照组。3.在有效浓度范围内,EGFP的荧光在器官保存的兔角膜内皮层强烈表达,随时间延长强度逐渐降低。5×107~5×108vp/μL AdV是载体滴度最为适宜的转染组,转染组中EGFP在角膜内皮细胞中的表达面积为67～84%,相对表达强度为34～75。过高浓度AdV(5×109vp/μL)导致ECD值显著下降。4.④和⑤组(即器官培养保存的同种异体全角膜和单纯异种异体内皮层移植组)的植片存活时间明显长于②和③手术组(即新鲜同种异体PKP组和联合器官培养保存的异种异体内皮层移植组),又以⑤组的存活期最长。术后各组血清和房水中IL-2、IFN-γ、IL-4和TNF-α的含量与排斥反应程度成正比,以②组最高,⑤组最低;各组植片内CD25的表达无显著差别;IFN-γ、TNF-α、IL-4和CD25mRNA在植片内的表达水平也与植片排斥程度成正比;外周血淋巴细胞中CD25亚群表达水平升高不明显,而CD28亚群的表达明显增强并与植片排斥程度成正比。结论1.无血清的ECM和ACF培养基在保持内皮细胞活力方面体现出了比常规含低浓度血清的MEM基础培养基更好的保护作用,在无血清器官培养保存角膜方面极具发展潜力。2. HES能有效避免器官培养过程中角膜过度水肿,且细胞毒性小可以成为器官保存液中的持续添加组分。它的应用也简化了保存程序,在一定程度上减轻了感染风险,有希望成为角膜器官培养保存法中的新型脱水剂。3.器官培养法保存后的角膜内皮细胞层可以同新鲜角膜一样被腺病毒载体高效率、特异性地转染成功并持续表达,转染效率只略低于新鲜角膜片。EGFP是监测这一转染过程的理想标记物。4. Th1/Th2平衡调节机制和CD28+T细胞亚群在器官培养法保存角膜移植后的免疫排斥反应中发挥了重要作用;动态检测外周血CD28和IFN-γ等Th1因子和Th2因子的表达有助于临床了解局部免疫反应进程并预测排斥反应的发生。器官培养法保存的角膜,无论是以全层还是单纯DM+CEC复合体形式进行移植,术后植片的存活时间都得以延长。促进Th2因子表达,抑制Th1类因子表达可能有益于降低排斥反应。同基因大鼠去CEC角膜联合器官保存兔异种CEC移植取得了最佳效果,为深层角膜病患者及时有效复明提供了新思路。