肝脏疾病严重威胁人类健康。据统计,全世界每年约有140万人死于由肝炎、感染、肿瘤等慢性肝脏疾病引起的晚期终末肝功能衰竭。原位肝移植(Orthotopic Liver Transplantation, OLT)是目前治疗肝衰竭最主要的治疗手段,但由于肝源短缺,费用高昂等问题,使得肝移植惠及的人群非常有限,难以广泛开展。近年来,生物人工肝(Bioartificial Liver, BAL)和肝细胞移植(Liver cell Transplantation, LCT)开始作为肝移植的辅助或替代疗法而日益受到人们的关注。然而,细胞来源不足一直是两者发展及应用的一大瓶颈。20世纪90年代以来兴起的干细胞技术日渐成熟,成为生命科学领域的研究热点。以干细胞移植为主的细胞疗法作为一种新兴的手段,为解决种子细胞来源和肝脏疾病的治疗提供了新的思路和方法。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是一类具有自我复制功能和分化潜能的早期未分化细胞,属于成体干细胞的一种,具有很强的可塑性,可以跨越胚层横向分化为肝样细胞等多种组织细胞,且具备取材方便、体外培养技术成熟以及自体移植等优点,因此其有望成为组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。如何高效诱导BMSCs向肝样细胞分化,是干细胞移植等肝病治疗的关键,但由于其具体的分化机制尚未明确,这一关键问题尚未得到满意解决,临床应用也远未达到预期效果。因此探究BMSCs向肝样细胞分化的分子机制意义重大。BMSCs向肝样细胞分化的事实已经得到了多数实验的证实,但其具体的分化机制尚存在争议。目前主要观点有：①横向分化学说：BMSCs本身具有多向分化潜能,可以分化为肝样细胞；②细胞融合学说：BMSCs首先与宿主肝细胞融合,然后进一步分化为肝样细胞。由于许多干细胞分化实验并未发现细胞融合的现象,故目前多数学者更支持横向分化学说,然而BMSCs横向分化的具体调控机制仍不清楚。由于微环境是干细胞赖以生存的“土壤”,因此众多研究人员将其作为干细胞定向分化机制研究的切入点。细胞局部的微环境包括细胞周围多种细胞因子、激素、基质细胞和细胞外基质等。细胞因子的作用尤为重要,在不同的细胞因子作用下BMSCs可分化为不同的细胞类型。微环境中的各种因子的表现类型、浓度和作用次序是影响BMSCs分化的重要因素。不同时期、不同部位、不同状态下微环境的组成及结构不同,对干细胞的影响也不同。正常情况下,微环境保护干细胞不被清除,维持干细胞的未分化状态,同时抑制其过度增殖；当机体受到损害时,微环境发生相应改变,通过一定的信号通路传递,有选择地激活或抑制相关转录因子,启动相关基因,从而出现特定的转录和翻译水平调控,进而使干细胞向特定成体细胞分化。基于以上观点,我们提出肝衰竭的肝内微环境中存在着某些有别于生理状态下的生物因子,这些因子能够刺激BMSCs向肝样细胞分化。为了探寻究竟是何种生物因子在发挥诱导作用,我们课题组在前期利用蛋白组学技术对比肝衰竭大鼠和健康大鼠肝脏,筛选出27个有显著差异的蛋白位点,通过生物信息学分析我们发现其中的酪蛋白激酶Iα(上调)、T盒转录因子(上调)和酪氨酸蛋白激酶(下调)与细胞的增殖、分化密切相关。酪蛋白激酶Iα (Casein kinase lα, CKIα)是一类具有独特理化特性的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,广泛存在于真核生物中,且分布广泛,主要分布在细胞质、细胞膜等部位。具有组成型活力(即被分离或者原核表达的CKIα都具有活性)。CKIα可磷酸化底物蛋白质中已被磷酸化的位点,也可作为其它蛋白激酶的底物被磷酸化,参与蛋白质的级联磷酸化过程,在信号转导中发挥作用,进而参与包括基因表达、细胞增殖及分化等多种细胞调节过程。研究已经证实CKIa主要参与Wnt和Hh信号转导通路,而该两条信号通路与干细胞的分化和增殖密切相关。肝衰竭微环境中CKIa明显上调,这些CKIa来自于何处：是受损的肝实质细胞表达的,还是微环境的变化刺激干细胞分泌的?尚不清楚。而上调的CKIa能促进BMSC肝样分化是外源性的CKIa直接刺激BMSCs,还是微环境中某些因素诱导BMSCs自身过表达CKIα,继而这些内源性表达的CKIα促进BMSCs分化呢?这些问题也是我们课题组一直欲研究探讨的。因此,本研究中的第一部分拟采用分子生物学技术,利用原核表达体系从大肠杆菌中表达出重组CKIα,并拟用Ni柱亲和层析使其得以高效纯化,为下一步我们进行CKIα与BMSCs共培养实验研究做前期准备,也为我们进一步探讨CKIα的生物学功能和研究它在BMSCs向肝样细胞分化过程中的作用奠定基础。本研究的第二部分我们拟通过Gateway技术构建可诱导表达CKIα基因的慢病毒载体,再通过转染大鼠BMSCs,获得CKIα过表达的BMSCs模型,从而为下一步可诱导表达CKIα的鼠BMSCs肝向分化的体内外实验研究奠定基础。第一章大鼠CKIα的原核表达及纯化目的：构建大鼠CKIα表达质粒,采用大肠杆菌原核表达系统制备重组CKIα并将其纯化,获得浓度高、纯度好的重组CKIα。方法：RNA提取试剂盒分离、纯化大鼠肝细胞总RNA。然后再以RNA为模板,以随机六聚体核苷酸为引物,在M-MLV逆转录酶的作用下进行反应,合成cDNA的第一链。根据GenBank报道的大鼠CKIa的编码序列,设计扩增大鼠CKIa基因的两对引物,分别在内侧上下游引物5’端加上限制性酶切位点NdeI和BamHI。以RT反应产物cDNA为模板,用TaqDNA聚合酶进行巢式PCR扩增CKIa基因。用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR扩增产物后,将其插入原核表达质粒pET-16b,构建重组质粒pET-16b-CKIα,经酶切和DNA测序鉴定后,将pET-16b-CKIα转化大肠杆菌Stbl3感受态细菌。再将工程菌以1：100接种于含有葡萄糖和甘油的LB培养基中,37℃振荡培养至OD值约0.5-1.0,之后继续培养3小时。4℃离心收集细菌,洗涤,超声破碎。1200r/min离心洗涤,分离包涵体。沉淀用含0.5%的Triton洗涤3次,纯化包涵体。用8M尿素溶解包涵体,然后用凝胶过滤纯化目的蛋白,并用Western blotting对重组CKIa样品进行分析鉴定。结果：1、经核苷酸序列测定和NdeI/BamHI双酶切鉴定结果表明,成功构建了重组质粒pET-16b-CKIα;2、经Ni-NTA柱亲和纯化后的重组CKIa经Western blotting检测,在30kDa和40kDa之间可见明显增浓的大小约为38kDa的蛋白条带,并在胶片上有相应的曝光条带,与预期大小相符。结论：1、成功构建了pET-16b-CKIα原核表达载体,将其转化至大肠杆菌后表达出CKIα的重组蛋白；2、初步摸索优化了重组大鼠CKIα的表达条件,包含体提取步骤,初步纯化工艺；3、成功克隆了大鼠CKIα基因,序列分析和文献报道一致；4、纯化获得重组CKIα,为进一步蛋白质生物学功能鉴定和探讨其在骨髓间充质干细胞的肝向分化中的作用研究奠定了一定基础。第二章携带大鼠CKIa基因慢病毒载体的构建及转染鼠BMSCs的实验研究目的：构建可诱导表达CKIa基因的慢病毒载体,转染人胚胎肾上皮细胞系293FT细胞获得相应的病毒颗粒,感染并获得在强力霉素诱导条件下稳定、高效表达CKIa的BMSCs,为下一步可诱导表达CKIa的鼠BMSCs肝向分化的体内外实验研究奠定基础。方法：以pcDNA-CKIa为模板,采用聚合酶链反应法扩增前后端带有attB重组位点的CKIa全长序列。利用Gateway载体构建技术,将扩增产物通过BP反应克隆至pDown载体中,测序正确后,采用LR重组酶将pDown-CKIa, pUP-EF1A和pLV.Des3d.p/neo进行重组反应,构建慢病毒载体表达质粒pLV.Des3d.P/neo-EF1A-CKIα-IRES/eGFP。然后将pLV.Des3d.P/neo-EF1A-CKI a-IRES/eGFP与包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5)混合,利用脂质体共同转染293FT细胞,包装携带CKIa基因的慢病毒颗粒,然后感染大鼠BMSCs。在强力霉素(doxcycline)的诱导下,应用RT-PCR方法检测感染BMSCs CKIa基因表达情况,应用Western blotting方法检测感染BMSCs CKIa的表达情况。结果：通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证可诱导CKIa真核表达慢病毒载体构建成功；pLV.Des3d.P/neo-EF1A-CKIa-IRES/eGFP与包装质粒共转染包装细胞293FT细胞,成功获得携带CKIa基因的慢病毒颗粒,包装产生病毒滴度为CKIa组5×107TU/ml,继之感染大鼠BMSCs,在强力霉素诱导条件下,经过荧光显微镜检测感染率达90%以上,应用RT-PCR方法检测重组CKIα基因表达情况,证实转染组基因水平的表达量为阳性,未转染组为阴性。应用Western blotting方法检测CKIa表达情况,证实转染组细胞表达阳性：未转染组表达为阴性。结论：成功构建出可诱导表达CKIa基因的慢病毒载体,获得浓缩Lentiviral-CKIa病毒液,在此基础上最终获得可以在强力霉素诱导条件下CKIa过表达的BMSCs模型,为下一步可诱导表达CKIa的鼠BMSCs肝向分化的体内外研究奠定基础。