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宫颈癌是一类仅次于乳腺癌的主要恶性肿瘤之一,位居女性恶性肿瘤第二,严重威胁妇女生命健康。但是目前使用的环磷酰胺等化学合成药物,在杀伤肿瘤细胞的同时,也杀伤造血组织细胞,甚至导致机体免疫功能下降,引起严重致死性并发症。因此,天然药物以安全、有效、副作用小等特点逐渐引起人们关注。红松树皮活性成份前花青素(PKBPE)和白芷生物碱(AAD)作为天然药物,生物活性强,具有防癌、抗突变及抑制酪氨酸酶等作用,是天然抗氧化剂。但迄今为止,关于PKBPE和AAD对宫颈癌治疗的研究,国内外一直未见相关报道。本研究采用有机溶剂结合大孔树脂柱层析和超声波方法分别提取PKBPE和AAD,并对其进行分离、纯化和鉴定。体内试验以U14移植性实体瘤小鼠为模型,将其分为阴性对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组、PKBPE低剂量组、高剂量组和AAD低、高剂量组。采用HE染色法、免疫组织化学SP法、比色分析法和ELISA法,对PKBPE和AAD抗宫颈癌作用进行了研究;体外细胞试验以HeLa细胞为试验材料,采用MTT法、TRAP银染法、光镜和透射电镜技术、流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳、Western blot和RT-PCR技术,分析了PKBPE和AAD对HeLa细胞的抑制和诱导凋亡作用,并获得如下研究结果。本试验通过对红松树皮前花青素的提取,得到红棕色粉末,得率为2.3%且含量为22.84mg/g,经鉴定为前花青素;通过对白芷生物碱的提取,得白色结晶,得率为2%,经鉴定为白芷生物碱且含量为0.16mg/g。动物体内试验表明,PKBPE和AAD能明显延长U14腹水瘤小鼠的存活时间,并能有效地抑制U14荷瘤鼠瘤体生长。对细胞周期进行测定,PKBPE和AAD能有效阻止肿瘤细胞于G0/G1期,肿瘤细胞内突变型P53、Ki-67、PCNA和Bcl-2相关蛋白表达量降低,但对肝脏和肾脏未产生损伤。通过对U14荷瘤鼠免疫和抗氧化功能测定表明,PKBPE和AAD能显著提高小鼠血浆中SOD活性水平,明显降低血浆MDA含量;胸腺指数与脾指数均显著提高,耳廓肿胀度明显低于对照组(P<0.05),并小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力显著提高(P<0.01),吞噬率增加。通过对血清中相关细胞因子进行测定,PKBPE和AAD可使TNF-α升高(P<0.01),IL-8水平明显降低(P<0.01),IL-2生物活性也显著高于对照组。HeLa细胞试验证实,PKBPE和AAD对HeLa细胞的IC50分别是196.38μg/ml和387.45μg/ml,这揭示PKBPE和AAD不仅可明显抑制细胞生长,而且能显著上调HeLa细胞Caspase-3活性,使HeLa细胞的琼脂糖电泳出现明显“梯状”条带,并存在剂量依赖性。通过对HeLa细胞周期测定,PKBPE和AAD可影响肿瘤细胞内DNA复制和合成,抑制细胞正常分裂,阻滞细胞进入S期,从而使细胞在G1期堆积,出现G2/M阻滞,有丝分裂终止,从而抑制细胞增殖,导致肿瘤细胞凋亡。对超微结构进行电镜观察,PKBPE和AAD能使HeLa显示典型的凋亡特征。同时,通过Western blot分析,细胞内Bax蛋白表达上调,而Bcl-2和Survivin蛋白表达下调,并其作用强度在一定范围内呈现明显的浓度和时间依赖性。RT-PCR检测表明,PKBPE和AAD对抑凋亡基因Bcl-2影响不明显,能明显增加促凋亡基因Bax的表达。这些结果充分揭示PKBPE和AAD可诱导HeLa细胞的凋亡。本文以U14荷瘤鼠和HeLa细胞为试验材料,通过体内外试验,免疫组织化学SP法、ELISA法、MTT法、透射电镜技术、流式细胞术、Western blot和RT-PCR技术等对相关蛋白、细胞因子、超微结构和细胞凋亡等进行分析,较系统地研究了PKBPE和AAD抗宫颈癌的作用及其作用机理,该研究为PKBPE和AAD治疗宫颈癌提供了重要的科学依据和理论基础。