论文部分内容阅读
海洋微藻因其特殊生长环境而使其含有一些结构特异的活性物质，并具有生长快、产量高、可定向培养、易调控等特点，成为开发新型天然药物的潜在资源。高速逆流色谱（High Speed Counter Current Chromatography，HSCCC）作为一种液液分配色谱，具有操作简单、分离量大、避免样品吸附等特点。本研究探讨将此技术应用于海洋微藻活性物质分离纯化中，目的在于建立一种高效、快速的微藻活性物质的分离提取方法，为海洋微藻微量活性物质获取提供一种新的途径。实验选用两种海洋金藻为实验材料，在溶剂体系筛选的基础上，建立高速逆流色谱法分离活性化合物的方法，并对并对分离纯化的化合物进行结构鉴定和体外抑菌实验考察其抗菌活性。主要研究结果如下：（1）在利用HSCCC从卢氏藻（Ruttnera spectabilis）粗提物中提取分离活性物质的实验中，根据溶剂体系对分离物质的溶解性、分层时间、分离过程中固定相保留率等指标进行溶剂体系筛选，获得5种较为理想的三相溶剂体系。分别采用筛选的5种的溶剂体系，用高速逆流色谱分离卢氏藻中的活性化合物，根据分离效果确定确定正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水（4:4:3:4，v:v:v:v）的三相溶剂体系为高速逆流色谱的最佳分离体系。并以上相和中相为固定相，下相为流动相进行洗脱，得到RS1、RS2、RS3三个组份，经HPLC纯度检测，RS1为极性较强的单一化合物。采用GC-MS进行结构鉴定为12-羟基-顺-9-十八碳烯酸，其纯度为87%。经体外抑菌活性筛选显示：RS1对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌都有很好的抑菌效果，RS2对细菌有抑菌效果，对真菌无抑菌作用，RS3没有抑菌活性。（2）采用参比溶剂体系与高效液相色谱测定分配系数法进行溶剂体系的筛选，得到正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水比例为（5:2:5:2，v:v:v:v）的两相溶剂体系为最佳体系。其后以上相为固定相，下相为流动相，研究了金藻Sarcinochrysis marina Geitler粗提物分离纯化的方法，并通过对分离过程中影响分离效果的溶剂体系中甲酸含量、样品上样量和流动相的流速的优化。确定最佳分离条件：溶剂体系中甲酸的含量1%，样品的上样量为75mg，流动相的流速为2mL/min，检测波长为280nm，仪器转速为900r/min，经分离得SG1、SG2、SG3三个组分，其中SG3纯度为92%，结构鉴定为十四烷酸（肉豆蔻酸）。抗菌实验结果表明SG1与SG2对所有实验菌种都有较好的抑菌活性，SG3对大肠杆菌抑菌活性不明显，对其他菌种也有较强的抑菌活性。（3）SG1组分的再分离：以SG1在两相溶剂中的分配系数为指标再次进行溶剂体系的筛选，获得含1%甲酸的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（4:5:4:3.5，v:v:v:v）最佳溶剂体系，并对上样量进行了优化实验，确定为50mg。其后以上相为固定相，下相为流动相洗脱，分离得到馏分Ⅲ和馏分Ⅳ两纯组份，经鉴定分别为（Z）-15-二十四碳烯酸，（Z）-9-十八碳烯酸，纯度分别为94%和97%。抗菌活性实验表明：两种化合物对细菌和真菌都有一定的抗菌活性的作用，且抗细菌活性比抗真菌活性要强。其中馏分Ⅲ的抗细菌活性要比馏分Ⅳ要差，抗真菌活性比馏分Ⅳ要强，且两种化合物对细菌中革兰氏阳性菌的抑菌活性大于对革兰氏阴性菌的抑菌活性。