褐飞虱Nilaparvata luges Stal (Brown planthopper, BPH)是危害水稻最严重的害虫之一,生产上主要以化学防治为主。但是长期以来对化学药剂的依赖,导致了褐飞虱对各种长期使用的常规杀虫剂甚至新型的杀虫剂都已经产生了严重的抗性。氟虫腈是防治褐飞虱的重要杀虫剂之一,但是前期研究发现田间褐飞虱普遍对氟虫腈的敏感性明显下降,很多地区的田间种群甚至产生了高水平的抗性。为了进一步了解褐飞虱对氟虫腈的抗药性机制,建立有效的抗药性治理策略,提高药剂的药效和合理使用方法,本文通过田间褐飞虱的抗性生物测定、室内敏感品系的诱变、氟虫腈高剂量筛选,分析筛选试虫靶标基因序列的多态性变化,鉴定关键多态性位点,并通过外源表达分析了多态性位点对应的氨基酸变化对氟虫腈敏感性的影响,发现了GABA受体Rdl亚基的抗药性相关的功能突变位点。具体结果汇报如下。一、褐飞虱对氟虫腈的抗药性调查对2010年采自南宁等12个地区的褐飞虱田间种群进行了抗药性监测,并以室内连续饲养多年的敏感品系作为敏感基线,以改进的稻茎浸渍法作为生物测定方法。结果发现,12个田间褐飞虱种群均已对氟虫腈产生了明显的抗性,以南京等5个地区的抗性更为显著,其中南京地区的田间褐飞虱种群对氟虫腈的抗性已达到了65.74倍。可见,不同地区褐飞虱种群均已经对氟虫腈产生了高水平抗性,部分地区抗性水平超过50倍,而且地区之间存在较大差异。这说明了田间褐飞虱种群对氟虫腈抗性发展迅速。2010年褐飞虱对氟虫腈抗性的快速上升,可能与2007-2009年间氟虫腈大量应用于褐飞虱防治有关,说明高效杀虫剂的连续单一使用,很容易导致害虫抗药性的产生,与褐飞虱对吡虫啉抗性发展相一致。二、田间褐飞虱RDL亚基功能区氨基酸多态性分析根据已有的褐飞虱Rdl亚基核苷酸序列设计特异性引物,并采用降落PCR与半巢式PCR相结合的技术扩增了褐飞虱室内敏感品系与28个不同地区的田间抗性种群GABA受体Rd1亚基功能区的cDNA片段,测序并进行序列对比分析。结果发现,在检测的28个地理种群中,有21个地区的种群发生了不同数量的氨基酸替换,并且有部分氨基酸多态性在不同地区的褐飞虱种群中都有发生。选取抗性水平较高、多态性较多的3个种群(福州、南京、重庆)进行了高剂量筛选和多态性变化研究,发现了R282Q、A284G、Y258S和A284S多态性在筛选后得到不同程度的增加,部分多态性发生在氟虫腈结合区域(跨膜片段TM1-TM3)上,预示着这些氨基酸替换可能在抗药性中起重要作用。三、室内褐飞虱诱变品系RDL亚基功能区氨基酸多态性分析利用紫外照射和秋水仙素两种诱变方法对室内褐飞虱种群进行诱变,并对诱变品系进行高剂量氟虫腈筛选,然后对筛选出来的褐飞虱进行Rdl亚基功能区序列测定并与敏感品系序列相对比。结果在Rdl亚基的第二跨膜区域发现了2个氨基酸替换(R282Q和M293I),并且其中一个氨基酸替换(R282Q)在田间种群中也发生了同样的突变。由此分析认为,这一突变很可能与褐飞虱膜蛋白的结合能力下降以及氟虫腈靶标抗性有关。四、氨基酸多态性在褐飞虱对氟虫腈选择性中的影响针对田间种群和诱变种群中发现的关键位点突变,在非洲爪蟾卵母细胞中进行敏感型和突变型Rdl受体表达,检测Y258S、R282Q、A284S、A284G以及R282Q/A284S氨基酸替换对氟虫腈敏感性的影响。利用双电极电压钳记录技术,记录了突变对GABA反应和氟虫腈对GABA反应抑制作用的影响。结果发现,对氟虫腈的敏感性与敏感型受体相比,Y258S和R282Q的影响相对较小：A284S和A284G使靶标对氟虫腈的敏感性下降到了另一个新的水平；而R282Q/A284S氨基酸替换使得靶标对氟虫腈的敏感性大大降低,这不仅说明A284氨基酸突变在褐飞虱对氟虫腈的抗性中起重要的作用,而且预示着,田间种群的靶标变异可能不仅仅来自于单个氨基酸替换,可能是多个氨基酸替换的共同效果。因此,本研究对氟虫腈抗性的分子机制的理解具有重要意义,进一步明确田间种群主效靶标变异后,可以应用于褐飞虱对氟虫腈及其类似杀虫剂抗性的治理和褐飞虱的综合防治。