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肿瘤血管靶向治疗的策略由来已久,它通过抑制肿瘤的新生血管生成来阻断肿瘤组织养分的供给,达到抑制肿瘤的生长的目的。这种治疗方案具有毒副作用小、不会产生抗药性、广谱性等优点。整合素家族是一类细胞粘附分子,整合素αvβ3在肿瘤血管发生和肿瘤的迁移中发挥重要的作用。整合素的单克隆抗体可以通过竞争性占据受体和配体结合的部位,阻碍整合素和配体的结合,抑制整合素发挥促肿瘤血管生成和肿瘤扩散的作用。组织因子是体内活性最强的凝血因子之一,其胞外区又称为可溶性组织因子（sTF）,是凝血活性的关键部位,可溶性组织因子可以引起肿瘤组织内的凝血反应,造成血栓,造成肿瘤的坏死。本研究利用本室“十五”863课题的研究成果——抗-αvβ3人源化抗体,研究其单链抗体（scFv）结合肿瘤血管的能力,同时将抗-αvβ3与可溶性组织因子基因融合,并在大肠杆菌中以可溶性形式表达,制备双功能的融合分子（既能阻断αvβ3的促血管生成活性,又能诱导肿瘤血管内凝血）,为后续可能的动物实验和最终开发出具有自主知识产权的抗肿瘤血管生成药物打下基础。首先,利用网站http://mail.ncifcrf.go v/dnaworks/进行在线引物设计,输入可溶性组织因子（sTF）氨基酸序列,选择大肠杆菌偏好的密码子,设置引物的长度为40mer,选择所需的引物复性温度为64°C,设计了34条重叠引物。采用组装PCR的方法人工合成sTF基因。PCR产物纯化回收后克隆到pMD18载体上进行测序,采用DREAM技术纠正突变,最终获得了同设计的目标序列完全一致的克隆。同时,采用融合PCR技术,根据已经测序的人整合素αvβ3的人源化Fab抗体B12克隆的序列,通过计算机软件设计了3对特异性引物分别扩增抗体的轻链和重链基因。扩增的PCR产物纯化和回收后克隆到pMD18载体上进行测序。序列分析表明,融合PCR技术扩增的抗人αvβ3的人源化scFv抗体产物与设计的目标基因序列完全一致。采用酶切连接的方法,分别将上述scfv和sTF基因克隆到pUC18载体中,构建质粒pUC18-scfv-sTF。以pUC18-scfv-sTF为模板,设计了2条引物,通过PCR的方法扩增scfv-sTF。PCR产物测序正确后克隆到pQE80L载体,经转化和酶切鉴定后获得scfv-sTF融合表达质粒pQE80L-scfv-sTF。同时设计了互补的两条引物,混合变性后退火获得两侧带有粘性末端的双链寡DNA接头,通过酶切方式以该DNA接头替换pQE80L-scfv-sTF中的sTF序列获得了抗-αvβ3 scfv单独表达的质粒pQE80L-scfv。将表达质粒pQE80L-scfv-sTF和pQE80L-scfv分别转化M15感受态,挑取单菌落于新鲜氨苄LB培养基中培养,37°C培养至对数生长期,加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG继续37°C培养6h后收集菌体,超声裂解菌体后,SDS-PAGE分析上清和沉淀。结果表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,但是仍有少量可溶性蛋白表达。通过逐步减低诱导温度和IPTG浓度来提高可溶性蛋白的表达量,在培养温度为26°C、IPTG终浓度为0.04mmol/L的条件下获得了较高的可溶性蛋白表达。由于重组蛋白带有6His标签,因此采用镍柱回收的方式回收目的蛋白。按照镍柱纯化的说明书操作,超声后的上清经过0.45um微孔滤膜过滤后上样过柱,然后用15倍体积的结合缓冲液（20mM Tris-HCl PH8.0, 10mM咪唑, 0.5M NaCl）洗柱并收集过柱液;最后用洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl PH8.0, 300mM咪唑,0.5M NaCl）过柱并收集洗脱液。SDS-PAGE分析回收的结果。采用超滤的方式将重组蛋白的缓冲液置换为PBS缓冲液,最后用Bradford蛋白定量试剂盒测量回收的目的蛋白浓度。采用酶联免疫吸附法（ELISA）和Western blotting的方法来验证重组蛋白和人整合素αvβ3抗原的结合能力。人整合素αvβ3抗原包被ELISA板,4°C过夜后用10%脱脂奶粉封闭。梯度稀释的重组蛋白scfv-stf和scfv作为待检一抗,人整合素αvβ3单克隆抗体为阳性对照,同样带有6His标签的HCV NS3C蛋白作为阴性对照。分别加入辣根过氧化氢酶标记标记的anti-His单克隆抗体和辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG后DAB显色,最后在酶联仪上读取450nm吸光值。结果显示重组蛋白scfv-stf和scfv可以和人整合素αvβ3抗原特异性结合。人整合素αvβ3抗原上样10%蛋白胶,SDS-PAGE电泳分离后4℃条件下100mA恒流转膜至PVDF膜上。10%脱脂奶粉37°C封闭2h,然后TBST洗膜液（20mM Tris-HCl PH8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20）洗膜4次。加入重组蛋白scfv和scfv-stf（1:5稀释）,阳性抗体标准品（1:1000稀释）,同时以带HIS标签的HCV NS3C蛋白作为阴性对照（1:5稀释）。TBST洗膜后加入分别加入辣根过氧化氢酶标记标记的anti-His单克隆抗体和辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG 37°C反应2h;TBST洗膜后采用ECL发光液发光显影至X光片。结果显示重组蛋白可以和人整合素αvβ3抗原特异性结合。采用Far-western blotting技术分析人整合素αvβ3抗原和重组蛋白的结合能力。28℃条件下诱导重组蛋白表达,收集的菌体经超声破碎后,取上清上样进行SDS-PAGE电泳。4℃条件下100mA恒流转膜将蛋白转移至PVDF膜上,采取膜上复性的方法将PVDF膜放置复性液中4℃过夜。TBST洗膜液洗膜后10%脱脂奶粉37°C封闭2h,然后依次加入一抗（人整合素αvβ3抗原）、二抗（抗人整合素αvβ3单克隆抗体）和辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG。TBST洗膜后采用ECL发光液发光显影至X光片。结果显示重组蛋白可以和人整合素αvβ3抗原特异性结合,同时也证实重组蛋白可以以可溶性形式表达。采用细胞免疫组化方法来验证重组蛋白和人整合素αvβ3抗原特异性结合。在盖玻片上培养人乳腺癌细胞系435s做成细胞涂片,室温条件下以丙酮固定细胞。PBS缓冲液复苏和洗涤后,10%脱脂奶粉37°C封闭1h,以重组蛋白和人整合素αvβ3单克隆抗体作为一抗4℃条件下过夜。PBS洗涤后加入二抗和显色液并在荧光显微镜下观察结果。结果显示重组蛋白和人整合素αvβ3抗原特异性结合。在钙和磷脂存在的条件下,TF具有引起血浆凝固的功能,因此采用蛋白磷脂化的方法来验证scfv-sTF蛋白是否具有凝血活性。scfv-stf蛋白经磷脂化后,加入参比血浆和氯化钙溶液,观察并记录凝血时间。结果显示磷脂化后的蛋白较未磷脂化的蛋白和阴性对照凝血时间明显降低,表明重组scFv-sTF具有良好的凝血活性。通过上述实验,我们成功地在原核细胞中高效表达了可溶性抗人αvβ3人源化单链抗体及其与人凝血因子的融合蛋白,并且以多种免疫学实验证明这些可溶性蛋白具有和人整合素抗原特异性结合的能力;利用体外凝血模型证明抗-αvβ3 scFv-sTF融合蛋白同时还具有凝血功能,这些研究为下一步动物模型研究打下了基础。