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造血（Haematopoiesis）是生物体维持免疫稳态的重要环节。血淋巴细胞是无脊椎动物主要的免疫细胞,其增殖和分化是无脊椎动物免疫防御的重要基础。在高等动物的免疫防御过程中,细胞自噬通过调节免疫细胞的增殖和分化来增强固有免疫,实现抗原呈递,清除病原并抑制炎症反应。而有关无脊椎动物细胞自噬对血淋巴细胞增殖调控的研究鲜有报道。本研究以长牡蛎（Crassostrea gigas）为研究对象,利用荧光定量PCR、Western blot、流式细胞术及细胞免疫荧光染色等方法,查明ROS水平对长牡蛎血淋巴细胞增殖的影响,探究ROS诱导血淋巴细胞自噬的机制,初步揭示长牡蛎抗细菌免疫中细胞自噬对血淋巴细胞增殖的潜在调控作用,取得的研究结果如下:1.LPS刺激后ROS上升,促进长牡蛎血淋巴细胞增殖分别注射海水（sea water,SW）,脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）和ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）后,检测长牡蛎血淋巴细胞内ROS水平,结果显示,LPS刺激后血淋巴细胞中的ROS水平显著高于SW组,而NAC刺激后血淋巴细胞中的ROS水平显著低于SW组。同时,血淋巴细胞中Ed U阳性细胞（Ed U+细胞）的比例差异显著,其中,LPS刺激12 h和24 h后Ed U+细胞的比例显著高于SW组,分别为SW组的2.98倍（p＜0.001）和2.04倍（p＜0.001）;相反,NAC刺激12 h和24 h后Ed U+细胞的比例显著低于SW组,分别为SW组的0.27倍（p＜0.001）和0.63倍（p＜0.05）。LPS处理后12 h,Ed U+无粒细胞、半粒细胞和颗粒细胞比例显著升高,分别为SW组的2.22倍（p＜0.05）、1.53倍（p＜0.01）和4.13倍（p＜0.001）,LPS处理后24 h,Ed U+无粒细胞、半粒细胞和颗粒细胞比例显著升高,分别为SW组的1.88倍（p＜0.01）、1.56倍（p＜0.01）和2.36倍（p＜0.001）;而抗氧化剂NAC处理后12 h,Ed U+半粒细胞和颗粒细胞的比例显著降低,分别为SW组的0.24倍（p＜0.001）和0.26倍（p＜0.001）,NAC处理后24 h,Ed U+无粒细胞、半粒细胞和颗粒细胞的比例显著降低,分别为SW组的0.31倍（p＜0.01）、0.66倍（p＜0.05）和0.62倍（p＜0.05）。以上结果表明,LPS能诱导ROS的产生和Ed U+细胞的增加。2.LPS刺激后ROS上升,诱导长牡蛎血淋巴细胞自噬运用RT-PCR及Western blot方法,检测了SW、LPS、NAC刺激后长牡蛎血淋巴细胞Cg LC3 m RNA和蛋白水平的表达变化,RT-PCR结果显示,LPS处理后12 h,Cg LC3 m RNA的相对表达水平显著上升,为SW组的1.25倍（p＜0.01）,NAC处理后12 h,Cg LC3 m RNA的相对表达水平显著下降,为SW组的0.49倍（p＜0.001）。LPS处理后12 h,LC3转化率显著升高,相反,NAC处理后12 h,LC3转化率显著降低。运用流式细胞术及细胞免疫荧光染色方法分析发现,LPS刺激12 h和24 h后自噬体CYTO-ID?标记的血淋巴细胞的比例显著高于SW组,分别为SW组的1.17倍（p＜0.01）和1.19倍（p＜0.05）;相反,NAC刺激12 h和24 h后,CYTO-ID?标记的血淋巴细胞比例显著低于SW组,分别为SW组的0.41倍（p＜0.001）和0.28倍（p＜0.001）。激光共聚焦显微镜观察自噬体绿色CYTO-ID?标记,与SW组相比,在LPS处理后的血淋巴细胞中观察到自噬体的绿色荧光斑点增加,而在NAC处理后的血淋巴细胞中几乎未见绿色荧光信号。以上研究表明,LPS刺激后ROS水平增加诱导了长牡蛎血淋巴细胞自噬的发生。3.LPS诱导细胞自噬调控长牡蛎颗粒细胞增殖为了探究细胞自噬在LPS诱导的细胞增殖中的潜在作用,采用氯化铵（Ammonium chloride,NH4Cl）抑制自噬体的降解。结果显示,在LPS+NH4Cl组,自噬体CYTO-ID?标记的血淋巴细胞比例相较LPS组显著上升,为LPS组的1.27倍（p＜0.01）。在LPS+NH4Cl组,Ed U+细胞占总血淋巴细胞的比例相较LPS组显著上升,为LPS组的1.22倍（p＜0.01）。同时,NH4Cl处理后12 h血淋巴细胞中Ed U+无粒细胞和半粒细胞的比例显著降低,分别为LPS组的0.51倍（p＜0.05）和0.55倍（p＜0.001）,而Ed U+颗粒细胞的比例显著升高,为LPS组的1.70倍（p＜0.01）。以上研究表明,NH4Cl刺激抑制血淋巴细胞自噬体降解,促进颗粒细胞增殖,提示LPS诱导细胞自噬调控长牡蛎颗粒细胞增殖。综上所述,LPS能诱导血淋巴细胞中ROS水平的升高,ROS进一步促进自噬的发生,进而参与调控颗粒细胞的增殖。本研究揭示了抗细菌免疫中细胞自噬对长牡蛎血淋巴细胞增殖的调控作用,为进一步研究长牡蛎的造血调控机制提供了良好借鉴与参考。