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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及多器官、多系统的自身免疫性疾病。其特征为T细胞过度活化,针对各种自身抗原产生大量的自身抗体。虽然SLE产生自身免疫反应的分子机制仍不清楚,但近年来越来越多的证据表明某些免疫相关基因启动子区的表观遗传调控机制改变在SLE的发生和发展中起到至关重要的作用。“表观遗传学”是指DNA序列不发生变化的稳定且可遗传的基因表达改变。其机制主要涉及DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA的调控等。目前关于SLE的表观遗传学研究多集中于DNA甲基化上,而关于组蛋白修饰,特别是特定基因调控序列上的组蛋白修饰在SLE发病机制中的作用研究非常有限。已知组蛋白修饰中,H3K27me3是基因沉默的标志,而H3K27me3的水平由组蛋白甲基转移酶EZH2和组蛋白去甲基化酶JMJD3共同调控。定向造血干细胞激酶1(Hematopoietic progenitor kinase1,HPK1)是一种哺乳动物Ste20相关的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,属于生发中心激酶(GCK)家族,它能负调控TCR信号和T细胞介导的免疫反应。本课题组前期研究利用染色质免疫沉淀微阵列技术(ChIP-on-chip)比较了5例正常对照和5例SLE患者CD4+T细胞基因启动子区域H3K27me3的差异,发现SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区H3K27me3水平显著高于健康人CD4+T细胞。如前所述,H3K27me3能抑制基因转录,因此,我们推测SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区H3K27me3水平可能较高,从而抑制了HPK1的表达。而HPK1又是TCR信号和T细胞介导的免疫反应的负调控子。由此,我们提出SLE的发病机理之一可能为：CD4+T细胞HPK1启动子区H3K27的甲基化酶表达过度或去甲基化酶表达减少→H3K27me3水平升高→HPK1表达受抑→T细胞过度活化→自身免疫反应→SLE。这一假定的发病机理将通过两个部分的研究来证实。第一部分,研究HPK1在SLE发病机理中的作用：(1)检测正常对照和SLE患者的CD4+T细胞中的HPK1表达水平；(2)在正常对照的CD4+T细胞中抑制HPK1的表达,在SLE患者的CD4+T细胞中过表达HPK1,检测对细胞增殖、IFNγ和IgG产量的影响。第二部分,研究SLE CD4+T细胞HPK1表达下调的组蛋白甲基化修饰异常机制：(1)检测正常对照和SLE患者的CD4+T细胞中HPK1启动子区H3K27me3的水平；(2)检测正常对照和SLE患者的CD4+T细胞中HPK1启动子区EZH2和JMJD3的水平；(3)在正常对照和SLE患者的CD4+T细胞中反向调节HPK1启动子区EZH2或/和JMJD3的水平,检测对HPK1表达水平的影响。通过这些研究揭示HPK1在SLE发生、发展中所发挥的作用及其异常的表观遗传调控机制,为SLE的治疗寻找新的有效途径提供理论依据。第一部分SLE患者CD4+T细胞HPK1的表达及其在自身免疫反应中的作用第一节SLE患者CD4+T细胞HPK1的表达目的：研究SLE患者CD4+T细胞中的HPK1表达改变及其与疾病状态的关系。方法：采用密度梯度离心法分离15例正常对照和15例SLE患者的外周血单个核细胞,免疫磁珠分选CD4+T细胞,实时定量一步法RT-PCR检测HPK1的mRNA水平,Western blotting检测HPK1的蛋白水平。结果：与正常对照比较,SLE患者CD4+T细胞HPK1mRNA水平显著降低(P=0.002)；未治疗和已治疗的SLE患者CD4+T细胞HPK1mRNA水平均较正常对照组显著降低(P=0.002；P=0.004)；而未治疗的与已治疗的SLE患者之间HPK1mRNA表达水平无明显差异(P=0.482)；SLE患者CD4+T细胞HPK1mRNA水平和SLE疾病活动指数(SLEDAI)呈显著负相关(R=-0.731,P=0.002)。SLE患者CD4+T细胞HPK1蛋白水平亦显著降低(P<0.001)；未治疗和已治疗的SLE患者CD4+T细胞HPK1蛋白水平均较正常对照组显著降低(P<0.001；P<0.001)；而未治疗的与已治疗的SLE患者之间HPK1蛋白表达水平无明显差异(P=0.712)。结论：SLE患者CD4+T细胞HPK1表达水平显著降低,且与疾病活动程度负相关,提示HPK1与SLE的发病有关。第二节下调HPK1表达诱导正常CD4+T细胞自身免疫反应目的：探讨抑制HPK1表达能否诱导正常CD4+T细胞自身免疫反应。方法：采用密度梯度离心法分离3个正常人的外周血单个核细胞，免疫磁珠分选CD4+T细胞和CD19+B细胞，设计针对HPK1的siRNA和对照siRNA，电穿孔法瞬时转染正常人的CD4+T细胞，采用Westernblotting检测HPK1蛋白表达水平，MTT检测细胞增殖活性，ELISA检测IFNy和IgG水平。结果：转染HPK1siRNA后，正常人的CD4+T细胞HPK1蛋白水平明显降低（P=0.001)，细胞增殖活性（P=0.012)、IFNy产量(P=0.008)、剌激自身B细胞产生IgG抗体量（P=0.005)均显著上升。结论：抑制HPK1的表达可诱导正常CD4+T细胞产生自身免疫反应。目的：探讨诱导HPK1过表达能否纠正或逆转SLE患者CD4+T细胞的自身反应性。方法:采用密度梯度离心法分离3个SLE患者的外周血单个核细胞，免疫磁珠分选CD4+T细胞和CD19+B细胞，电穿孔法将HPK1表达质粒及对照质粒瞬时转染SLE患者的CD4+T细胞，釆用Westernblotting检测HPK1蛋白表达水平,MTT检测细胞增殖活性,ELISA检测IFNγ和IgG水平。结果：转染HPK1表达质粒后,SLE患者CD4+T细胞HPK1蛋白水平明显上升(P=0.007),细胞增殖活性(P=0.009)、IFNγ产量(P=0.005)、刺激自身B细胞产生IgG抗体量(P=0.003)均显著下降。结论：诱导HPK1过表达可抑制SLE患者CD4+T细胞的自身免疫反应。第二部分SLE患者CD4+T细胞HPK1表达下调的组蛋白甲基化修饰异常机制第一节SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区H3K27me3的水平目的：研究SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区H3K27me3的水平及其与HPK1表达的关系。方法：采用第一部分第一节预留的标本,染色质免疫沉淀(ChIP)结合实时定量PCR检测HPK1启动子区H3K27me3的水平。结果：与正常对照相比,SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区H3K27me3的水平显著升高(P<0.001),且与HPK1mRNA水平显著负相关(R=-0.775,P=0.001)。结论：SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区H3K27me3水平升高,且与HPK1表达负相关,提示SLE患者CD4+T细胞HPK1表达下调可能与其启动子区H3K27me3水平升高有关。第二节SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区EZH2和JMJD3的水平目的：研究SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区EZH2和JMJD3的水平及其与H3K27me3水平和HPK1表达的关系。方法：采用第一部分第一节预留的标本,ChIP结合实时定量PCR检测HPK1启动子区EZH2和JMJD3的水平。结果：与正常对照相比,SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区JMJD3水平显著降低(P<0.001)；EZH2水平则无显著性差异(P=0.223)；SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区JMJD3水平与H3K27me3显著负相关(R=-0.756,P=0.001),而与HPK1mRNA水平显著正相关(R=0.645,P=0.009)。结论：SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区JMJD3下降导致H3K27me3水平上升可能是HPK1表达下调的关键所在。第三节下调正常CD4+T细胞HPK1启动子区JMJD3水平对HPK1表达的影响目的：探讨下调HPK1启动子区JMJD3水平对正常CD4+T细胞HPK1的表达及其启动子区H3K27me3水平的影响。方法：采用密度梯度离心法分离3个正常人的外周血单个核细胞,免疫磁珠分选CD4+T细胞,设计针对JMJD3的siRNA和对照siRNA,电穿孔法瞬时转染正常人的CD4+T细胞,采用Western blotting检测JMJD3和HPK1蛋白表达水平,ChIP结合实时定量PCR检测HPK1启动子区JMJD3和H3K27me3的水平。结果：转染JMJD3siRNA后,正常人的CD4+T细胞JMJD3和HPK1蛋白水平明显降低(P=0.002；P=0.002),HPK1启动子区JMJD3水平显著降低(P=0.012),而H3K27me3水平则显著上升(P=0.019)。结论：在正常CD4+T细胞中下调JMJD3水平可导致HPK1水平下降,而这一作用至少部分是通过下调HPK1启动子区JMJD3的水平,导致该区H3K27me3的水平升高而实现的。第四节上调SLE患者CD4+T细胞HPK1启动子区JMJD3水平对HPK1表达的影晌目的：探讨上调HPKl启动子区JMJD3水平对SLE患者CD4+T细胞HPK1的表达及其启动子区H3K27me3水平的影响。方法：采用密度梯度离心法分离3个SLE患者的外周血单个核细胞,免疫磁珠分选CD4+T细胞,电穿孔法将JMJD3表达质粒及对照质粒瞬时转染SLE患者的CD4+T细胞,采用Western blotting检测JMJD3和HPK1蛋白表达水平,ChIP结合实时定量PCR检测HPK1启动子区JMJD3和H3K27me3的水平。结果：转染JMJD3表达质粒后,SLE患者CD4+T细胞JMJD3和HPK1蛋白水平明显升高(P=0.003；P=0.006),HPK1启动子区JMJD3水平显著上升(P=0.003),而H3K27me3水平则显著下降(P=0.009)。结论：在SLE患者CD4+T细胞中诱导JMJD3过表达可导致HPK1水平上升,而这一作用至少部分是通过上调HPK1启动子区JMJD3的水平,导致该区H3K27me3的水平下降而实现的。