论文部分内容阅读
脊椎动物白介素17是一类重要的促炎细胞因子,可参与免疫防御和组织损伤修复等过程,对平衡机体内稳态和炎症反应起关键的调节作用。适度的炎症反应是机体抵抗外界环境胁迫的自我保护措施,过度的炎症反应则会导致免疫系统调节紊乱,产生自身免疫性疾病。目前在软体动物已有炎症反应的少量报道,但相关研究尚处于观察实验阶段,白介素17等促炎细胞因子在炎症反应中的作用尚不明确。本论文以长牡蛎为研究对象,采用分子生物学,细胞生物学和免疫学等技术,筛选并克隆了长牡蛎中白介素17及其信号通路相关分子,分析了其结构和功能特征,初步探讨了它们在环境胁迫应答中的的调节机制。在长牡蛎基因组中筛选出了10个白介素17分子,命名为CgIL17-1～CgIL17-10,分子间同源度较低,但在氨基酸序列的C端都具有4个非常保守的半胱氨酸位点,能形成类似于脊椎动物白介素17中所含半胱氨酸结节的三维结构。系统进化分析表明无脊椎与脊椎动物中的白介素17分子间存在显著差异,长牡蛎白介素17分子属于无脊椎动物白介素17大家族。10个分子广泛分布于长牡蛎各组织中,其中以鳃,外套膜和肝胰腺中表达量较高。10个分子在长牡蛎个体发育时期的表达模式各不相同。CgIL17-5在成体中表达水平较高且在菌刺激后表达量显著上升,进一步研究发现其不仅能激活免疫相关转录因子,诱导IL6的合成,而且具有PAMPs (LPS, PGN, poly (I:C)和β-1,3-glucan)结合活性,并能抑制藤黄微球菌和大肠杆菌的生长,对L929细胞表现出一定的毒害作用,是一个兼具信号转导和模式识别受体效应的多功能分子。在长牡蛎基因组中筛选出6个含有保守SEFIR结构域的分子,命名为CgSEFIR1～CgSEFIR6。其中CgSEFIR2和CgSEFIR4含有跨膜结构域,CgSEFIR6结构较为特殊,除C端保守的SEFIR结构域,在N端还含有一个DD结构域,与MyD88分子相似,结构预测分析表明这些分子可能参与白介素17信号转导过程。多序列比对和系统进化分析显示,6个CgSEFIR分子可以分为两类,一类与脊椎动物白介素17受体IL-17RD类似(CgSEFIR1,CgSEFIR2和CgSEFIR3),一类与接头蛋白CIKS类似(CgSEFIR4, CgSEFIR5和CgSEFIR6).基因共线性分析进一步表明牡蛎中受体类CgSEFIR与脊椎动物五大类白介素受体中的IL-17RD相似度更高。mRNA原位杂交实验显示,4个CgSEFIR分子(CgSEFIR1, CgSEFIR3, CgSEFIR5和CgSEFIR6)主要分布于肝胰腺小管,在鳃丝中有少量分布。LPS和PGN刺激后CgSEFIR1, CgSEFIR3和CgSEFIR6 mRNA表达量显著升高,而CgSEFIR5在LPS刺激后表达水平显著降低。利用哺乳动物细胞双杂交系统对4个CgSEFIR分子间及与CgTRAF6分子相互作用进行了验证,发现CgSEFIR5只与CgTRAF6司存在一定的相互作用,而CgSEFIR6除与CgTRAF6存在相互作用,还可以分别与CgSEFIR1和CgSEFIR3相互作用。双荧光实验表明,CgSEFIR1和CgSEFIR6的过表达均可以激活NF-kB信号通路,且CgSEFIR5和CgSEFIR6可以一定程度减弱MyD88对NF-kB信号通路的激活。发现在CgSEFIR1, CgSEFIR3和CgSEFIR6被干扰后,长牡蛎体内CgIL17诱导的下游CgAIF和CgMIF基因表达量显著降低,而在CgSEFIR5被干扰后,CgIL17对下游基因的诱导作用未见显著影响。研究发现长牡蛎血清中葡萄糖含量在干露后第三天开始显著上升,CgIL17-1和CgIL17-5表达量也显著升高。体内注射高剂量葡萄糖后发现,CgIL17-1和CgIL17-5基因表达量增加。通过组织切片观察发现,干露时间的延长会导致牡蛎肝胰腺中小管管壁变薄,管腔变大,外套膜中神经纤维萎缩,肌肉纤维退化。体内直接注射重组蛋白CgIL17-1和CgIL17-5后,发现长牡蛎中肝胰腺小管发生了与干露胁迫下相同的形态学变化,同时GSK3β的含量显著下降。CgIL17-1和CgIL17-5基因干扰实验进一步证实了其对GSK3β的抑制作用,且两基因分别被干扰后抗菌肽CgDefensin及与促凋亡相关的CgDAFF基因表达量显著降低,而与抑制凋亡相关的基因CgIAP表达量上升。同时,在CgIL17-1和CgIL17-5基因被干扰后,在干露的前三天长牡蛎的存活率降低,而在干露后期长牡蛎的存活率一定程度增加。综上所述,在软体动物长牡蛎中克隆获得了白介素17家族成员及其信号转导分子,它们具有与高等动物中同源分子相似的结构和功能,同样可参与到机体免疫防御和响应外界非生物胁迫过程中,在维持机体内稳态过程中发挥重要作用。白介素17可作为长牡蛎健康状态的潜在指示分子,白介素17及其信号转导相关分子的研究为长牡蛎的病害防控提供重要的理论指导。