论文部分内容阅读
卵巢癌是危害女性健康的常见恶性肿瘤之一，化疗是卵巢癌患者术后进行的辅助性治疗手段。阿霉素(Doxorubicin，DOX)是广泛用于卵巢癌等多种实体瘤的蒽环类化疗药物，而临床长期使用阿霉素会引起卵巢癌细胞产生多药耐药(MDR)，使之成为治疗卵巢癌的最大障碍，也是导致化疗失败的主要原因。MDR的形成是一个多机制共同作用的结果。目前有研究报道逃逸凋亡和增加药物外排与肿瘤细胞MDR形成密切相关。鉴于线粒体和膜蛋白分别在细胞凋亡和药物转运中具有重要作用，本课题以卵巢癌细胞系OVCAR8以及阿霉素抗性卵巢癌细胞系NCI/ADR-RES为模型，应用基于SILAC的定量蛋白质组技术比较了两个细胞系中线粒体蛋白和膜蛋白的表达差异，为研究卵巢癌细胞的耐药机理提供了最新的信息。 在定量线粒体蛋白质组研究中，我们将SILAC标记的两种细胞系等量混合，利用nycodenz密度梯度离心分离纯化线粒体，再通过2D-LC-MS/MS进行比较线粒体蛋白质组学分析，共定量到2085个蛋白，其中有122个蛋白的表达在NCI/ADR-RES细胞中发生了显著差异性变化。功能注释发现这些蛋白主要参与细胞凋亡、物质代谢、细胞结构、DNA修复、药物解毒以及药物代谢等多个细胞过程。随后，我们使用qRT-PCR和western blot对SILAC定量到的显著差异表达蛋白进行了验证，进一步的功能实验发现参与DNA修复的线粒体蛋白TOP1 MT和MDR相关。除了蛋白质组学研究显示线粒体蛋白参与MDR外，电镜和免疫荧光观察发现线粒体的形态和定位在NCI/ADR-RES细胞中都发生了改变。此外，在阿霉素抗性细胞NCI/ADR-RES中线粒体的膜电位（△Ψm）是降低的。这些蛋白质组数据和生物化学数据都提示线粒体是卵巢癌细胞阿霉素抗药性的一个关键靶点。 在定量膜蛋白质组研究中，我们将SILAC标记的两种细胞等量混合，使用差速离心结合高pH Na2CO3洗涤的方法富集膜蛋白，随后通过2D-LC-MS/MS进行比较膜蛋白质组分析，共定量到3229个蛋白，有214个蛋白存在显著表达差异。功能注释发现它们参与了物质转运、细胞凋亡、细胞粘附以及细胞周期调控等多个生物进程，如转运蛋白P-gp1和Rab、凋亡相关蛋白BCL2L12和DAPK1、细胞粘附分子EPCAM、ITGB2、ITGB4等。我们进一步使用qRT-PCR、western blot和免疫荧光验证了SILAC定量到的差异表达蛋白，并对参与信号转导、迁移和增殖的细胞粘附分子EPCAM进行shRNA敲低实验，发现它会促进DOX诱导的NCI/ADR-RES细胞凋亡，证明EPCAM的确参与到了NCI/ADR-RES细胞的DOX抵抗中，可作为逆转卵巢癌多药耐药提供新的治疗靶标。