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为寻找高效分解纤维素的真菌资源,从新疆不同地区采集到土样45份。以纤维素为唯一碳源对土壤样品进行初筛,得到40株能够分解利用纤维素的真菌菌株。将上述菌株在产酶培养基中培养,测定培养液上清中纤维素酶的活性,筛选出9个纤维素酶活性高的菌株。其中编号为X20-2的菌株分泌的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活力最高。
通过形态观察和分子系统学方法,对菌株X20-2进行鉴定。以菌株基因组DNA为模板,根据啤酒酵母rDNA保守区域设计引物,扩增出该菌株18SrDNA全长1785bp和5.8SrDNA137bp,通过与Genbank中的已知序列进行同源性比较,发现与葡萄穗霉属(Stachybotrys)相关菌株上述序列同源性分别在99%和100%,而两个ITS区(共468bp)与已知菌株的同源性只有92%;采用黑光灯照射诱导菌株产孢,结合菌体形态特征,观察分生孢子与孢子梗的形态,确定菌株X20-2为葡萄穗霉。毒理实验证明,该菌株培养液中不含毒素,可以进行安全的产酶培养。
通过单次单因子实验对菌株产生β-葡萄糖苷酶的条件进行优化,确定麦麸为产酶培养基的最适碳源。经过优化培养,β-葡萄糖苷酶活力从最初的4.9U/ml提高到9.37U/ml。测定粗酶对葡萄糖的耐受性,发现当葡萄糖浓度在10g/L时,该β-葡萄糖苷酶仍可保持原总酶活的28%。
粗酶液经硫酸铵沉淀和DEAE-52、HiTrap_DEAE_FF柱层析及MonoQ强阴离子层析柱纯化,获得X20-2菌株的β-葡萄糖苷酶,酶蛋白在SDS-PAGE中显示一条带,其分子量约为100kDa。其比活力达到29903.45U/mg,比粗酶液提高了143.5倍。酶学性质分析表明,该酶反应的最适温度为60℃,最适pH为5.6,并在60℃以内及碱性条件下稳定。Ag+、Cu2+、Zn2+和Fe3+对该酶有不同程度的抑制作用。