研究背景肺癌是当今世界上癌症相关死因中发生率最高的癌症种类之一,因此寻找有效的、不良反应小的、作用明确以及联合用药治疗策略是医药界研究的热点课题。羧胺三挫(Carboxyamidotriazole,CAI)是本课题组多年来研究的一种毒副作用很低的非细胞毒类新型抗癌药,其对体内/外多种肿瘤模型有良好的抑制作用,但是CAI在人体临床试验中表现的抗肿瘤作用较温和。为了增强CAI的药物治疗效果以及探索CAI的作用及作用机理,我们开展了三部分的研究:(1)评估CAI与索拉非尼(Sorafenib)协同抗肿瘤作用,并探讨其可能的机制;(2)探索CAI在恶病质小鼠中起到的保护性作用;(3)探寻CAI在肿瘤细胞提升磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)作用的上游机制。索拉非尼是一种口服的多激酶抑制剂,可通过抑制丝氨酸/苏氨酸激酶的活性,抑制恶性肿瘤细胞的增殖。同时可通过抑制PDGF和VEGF受体酪氨酸激酶的活性,而抑制内皮细胞的增殖。索拉非尼可以延长非小细胞肺癌患者的无进展生存期,但是总体疗效有限。本部分研究探索CAI与索拉非尼在非小细胞肺癌中的协同治疗作用以及其发挥协同作用可能的机制,旨在为非小细胞肺癌的临床治疗提供新的方案并提供理论依据。此外伴随癌症产生的癌性恶病质是一种以全身性系统性炎症反应为特征的紊乱综合症,它的发生不仅对患者的生活质量造成严重的不良影响,还可以使患者对化疗药物反应度降低并最终降低生存率。CAI除了具有抗癌特性之外其在多种疾病模型中均体现出良好的抗炎作用。基于CAI的这种抗炎特性,我们同时在此探讨CAI对肿瘤进展中出现的肌肉萎缩现象是否具有保护与治疗作用。我们在本研究中发现CAI对乙酰辅酶A竣化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)有抑制作用,为了更深入的探讨CAI抗肿瘤作用的具体分子机制,在此我们对于引起ACC抑制的上游信号通路进行探讨。研究方法用SRB法检测CAI和/或索拉非尼在三株非小细胞肺癌细胞株中的增殖抑制作用,并计算联合用药指数,并计算CAI对LLC细胞的半数抑制浓度(IC50)。用Annexin V/PI对细胞进行染色,并用流式细胞术的方法检测细胞凋亡比例。用DCFH-DA对细胞内活性氧进行染色并分别用荧光显微镜与流式细胞术的方法进行定性与定量分析。用MitoSox对线粒体特异的超氧化物进行染色并用流式细胞术检测。NANOG的mRNA和蛋白表达水平分别用荧光定量PCR和western blot进行分析。碱性成纤维生长因子(bFGF)作为NANOG的刺激剂,在LLC和A549细胞中与药物共孵育来考察NANOG在CAI和索拉非尼引起活性氧积累中的作用。使用GSH(ROS的清除剂)或bFGF与药物共孵育并用流式细胞术的方法对细胞凋亡比例进行检测。建立荷瘤小鼠模型,并评价CAI与索拉非尼在体内的抑制肿瘤的作用。建立晚期肺癌移植瘤模型,评估CAI对小鼠去瘤体重的保护作用。使用Western blot和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对给药29天后对其腓肠肌中的蛋白和mRNA表达水平的变化进行检测。用ELISA的方法检测血清中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平。CAI在体外对SIRT1的直接激活作用通过荧光定量的方法进行测定。用western blot方法检测CAI对磷酸化ACC水平的影响,并通过使用钙凋蛋白依赖性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)阻滞剂STO609、具有肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)突变的A549细胞、SIRT1抑制剂Ex 527和烟酰胺以及PKA抑制剂H-89与CAI共孵育,再检测磷酸化ACC的水平来判断上游信号通路对磷酸化ACC的影响。研究结果1.在非小细胞肺癌株(LLC、A549和NCI-H1975)中CAI与索拉非尼协同抑制细胞增殖。2.CAI与索拉非尼联合使用可以提升细胞凋亡水平以及上调cleaved-caspase 3和cleaved-PARP的水平。同时使用Z-VAD-FMK(pan-caspase抑制剂)与药物共孵育可以减少药物引起的细胞凋亡水平。3.CAI与索拉非尼合用可以诱导细胞内活性氧的积累,同时也提升线粒体特异的超氧化物的产生。4.CAI与索拉非尼合用可降低细胞中NANOG的mRNA与蛋白表达水平。在细胞中使用bFGF,可同时刺激细胞内NANOG的表达以及刺激细胞增殖。5.将bFGF与药物共孵育,可以减轻药物诱导的活性氧的产生。6.将GSH(活性氧清除剂)或bFGF与药物进行共孵育,可以减缓药物引发的细胞凋亡比例。7.在体内试验中,CAI与索拉非尼(10 mgkg-1)合用可以显著的抑制肿瘤的生长,这种抑制能力与索拉非尼高剂量单用组(30mgkg-1)相当。同时CAI和索拉非尼合用组与索拉非尼高剂量组比较,前者的小鼠去瘤体重更重。8.CAI和索拉非尼合用可以降低小鼠肿瘤组织中的NANOG的蛋白含量,并且可以提升肿瘤组织中的脂质过氧化水平。9.在癌性恶病质模型鼠中,从接种肿瘤细胞后第19天开始,CAI给药组小鼠的去瘤体重与溶剂对照组比表现出显著升高。实验结束时,CAI组小鼠的腓肠肌与附睾脂肪组织的重量比溶剂对照组有显著性的增加。10.在腓肠肌组织中CAI通过抑制与蛋白水解相关的Fox03转录因子的表达以及泛素连接酶E3(MuRFl和atrogin1)的表达来抑制肌肉组织的消耗。同时在肌肉组织中CAI表现出上调IκBα蛋白水平以及下调磷酸化IKKα/β体现出对NF-κB信号通路有效的抑制。并且CAI下调血清中的IL-6和TNF-α的含量,也下调肌肉中的TNF-α的水平。在体外实验中CAI体现出对SIRT1酶的直接激活作用,在腓肠肌组织中CAI组小鼠的SIRT1蛋白表达量显著上升。11.CAI在体外可以剂量依赖的提升细胞内磷酸化ACC的水平。12.CAI的提升磷酸化ACC水平的作用是非依赖CaMKKβ和LKB1的,同时是部分依赖于SIRT1和PKA活力的。研究结论CAI与索拉非尼在体内与体外实验中均可协同抑制非小细胞肺癌的增殖,其可能的机制是抑制细胞内NANOG的表达进而提升线粒体产生的活性氧的累积,并最终诱发细胞的凋亡。此外,CAI因其具有对NF-κB的抑制性作用以及对SIRT1的激活作用,则表现出缓解恶病质模型中肌肉消耗的现象。最后CAI通过部分依赖SIRT1和PKA而非依赖于CaMKKβ和LKB1的方式抑制ACC的作用。这可能是CAI引起上述细胞信号通路的作用靶点。