背景介绍: 近年来由于抗生素的大量使用，导致临床耐药株日益增多，故寻找新种类抗菌药成为当前的研究热点。自从瑞典科学家Boman在惜古比天蚕（Hyalophoracecropia）中发现抗菌肽以来，已有几百种抗菌肽被相继发现。抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性好、免疫原性较低、作用迅速的特点，不仅可以有效杀灭细菌、真菌、病毒和寄生虫，部分还有一定抗恶性肿瘤作用，并且不易产生耐药性，对真核细胞毒性作用低等特点，备受关注。其相应的原核、真核、昆虫等表达体系也被构建。但由于其本身的抗菌活性，使其很难在原核细胞的工程菌中表达，而真核等系统的表达量却难以达到要求。与传统抗生素相比某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想，改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高活性的有效途径。这就需要进一步研究抗菌肽结构与活性的关系，为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据。与抗菌肽相关的某些毒性作用、在动物机体内的稳定性等问题有待研究。但随着抗菌肽及转基因技术在理论和应用上更深入的研究，抗菌肽最终必将对人类医学产生深远影响。 目的: 通过将天蚕素A（cecropin A，CA）截短肽的串连融合表达，降低其对工程菌的毒性和提高其表达产量，为其产业化提供可能的方法。比较CA其两个α螺旋区域的活性是否一样，两个α螺旋和一个α螺旋的抑菌活性是否有区别，从而为改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子提高活性的途径，提供理论依据。通过了解CA的抗原性区域，制备高质量抗体，为以后更好的检测抗菌肽CA在异源表达系统中的表达情况及表达产量提供帮助。 方法: 1.使用蛋白质专家分析系统（ExPASy，http：//www.expasy.org/）的PredictProtein程序分析CA序列的二级结构，PROSITE SCAN程序分析其功能位点。根据二级结构和功能位点分析，选取氨基酸区域1～19作为CA19，18～36作为CA36，2～10和25～32通过GP连接作为CA210。 2.根据密码子的偏爱性设计合成3对反向互补的核苷酸单链，并在每条单链的3’端加上ATG尾。将3对核苷酸单链分别磷酸化后退火延伸。用连接酶将这3对核苷酸双链串连为不同拷贝数的串连体后构建于pET-31b（+）载体，转入大肠杆菌DH5α进行克隆，随机挑选菌落经PCR后用琼脂糖鉴定。 3.将鉴定阳性质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）上进行串连融合表达，并优化诱导表达条件。选择优化后的诱导条件进行诱导表达，用SDS-PAGE分析，Western-blot鉴定。 4.表达产物用亲和层析将其纯化后，融合蛋白用CNBr切割成单体，通过复性、冷冻干燥浓缩等步骤，分离、纯化和浓缩抗菌肽，用Tricine SDS-PAGE鉴定抗菌肽的纯度和性质。 5.用大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检测其抗菌活性。用微量稀释法检测其最小抑菌浓度。 6.将部分纯化的融合蛋白免疫BLAB/C小鼠，分别在第三、四次免疫一周后断尾取血，ELISA检测其效价。Western-blot鉴定其特异性。 结果: 1.将CA19、CA36、CA210的互补DNA双链经DNA连接酶作用后，成功构建了1～5个拷贝的串连体。琼脂糖电泳分析分别在其相应分子量的位置有特异性条带。转化入大肠杆菌DH5α的pET-31b（+）-CA19（CA36、CA210）1～5质粒经菌落PCR鉴定、琼脂糖电泳分析正确后测序，其插入位置和序列完全正确，成功构建了CA各截短肽的串连融合表达载体。 2.融合蛋白CA19（CA36、CA210）1～5，在37℃、IPTG浓度为0.2mmol、诱导时机为第2h加入、诱导3h后得到稳定的表达量，其中CA19-3、CA36-3和CA210-3的表达量最高，分别为37.5％、39.1％和38.8％。融合蛋白经SDS-PAGE分析，证实其大小一致，Western-blot鉴定有特异性条带。 3.亲和层析纯化后的重组蛋白用BandScan5.0分析其纯度均达90％以上。经CNBr切割获得单体，用Tricine SDS-PAGE鉴定在2kD处可见一条特异的目的条带。 4.抑菌实验显示CA各截短肽对各革兰氏阴性菌的抑菌能力强于革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌，抑菌活性从大到小为CA210>CA19>CA36。此外，通过微量稀释法得出各CA截短肽的最小抑菌浓度为16μg/ml～128μg/ml。 5.免疫的小鼠抗血清经ELISA检测，CA19、CA36、CA210第三次免疫后的效价，分别为1：2000、1：1000、1：1000，加强免疫后的效价分别为1：10000、1：5000、1：5000；抗血清用Western-blot鉴定可见特异性条带。而空载的诱导蛋白抗血清ELISA和Western-blot检测结果均为阴性。 结论: 1.成功构建了基于序列分析的天蚕素A各截短肽串连融合表达载体，为其不易被原核细胞工程菌表达和表达量低的问题，提供了可能的解决途径。 2.通过对天蚕素的序列分析，采用了其两个α螺旋区分别表达和联合表达，其中含两个α螺旋的CA210的抑菌活性最强，而含N端α螺旋的CA19比含C端Q螺旋的CA36抑菌活性强。可见抗菌肽的抑菌活性不只是和其α螺旋的个数有关，还和其它因素，如电荷数和疏水性等有关。从而为改造已有抗菌肽和设计新型抗菌肽分子提供理论依据。 3.针对天蚕素序列的不同区域用基因工程合成的多肽免疫动物，了解天蚕素不同区域的抗原性，制备高质量抗体，从而为检测天蚕素A在异源表达系统中的表达提供了工具。