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哺乳动物卵泡发育包括卵泡的生长和卵泡闭锁。卵泡的生长包括颗粒细胞的增殖、分化和周期的控制。然而,卵泡生长的过程中,只有少数的卵泡可以生长发育到排卵,大部分的卵泡在卵泡发育的过程中发生闭锁。研究发现,卵泡闭锁退化的过程是由卵泡中颗粒细胞的凋亡触发的,颗粒细胞的凋亡最终导致卵泡的闭锁。在卵泡颗粒细胞中可以分泌类固醇激素、促卵泡素和促黄体素等激素,还可以产生一些细胞因子,调控着卵泡和卵母细胞的生长发育。因此体外培养颗粒细胞模型是研究卵泡发育过程中基因调控的分子机制的必须模型。而颗粒细胞的凋亡也是一个复杂的过程,凋亡机制尚不十分明确。本研究通过体外培养猪颗粒细胞,利用体外添加抑制剂培养、RNA干扰、western blot (WB)、real time PCR、流式细胞仪检测、ELISA检测等方法,研究MAPK-CEBPβ通路对猪颗粒细胞中关键基因的表达、颗粒细胞中类固醇激素的分泌、颗粒细胞的凋亡和周期及其它们的调控机制的影响,揭示MAPK-CEBPp对猪颗粒细胞生长发育调控机制,进而获得该通路通过对颗粒细胞的调控参与对猪卵泡发育排卵、颗粒细胞黄体化的调控机制。本实验分为两个部分：实验一：MAPK3/1(ERK1/2)抑制剂1,4-二氨基-2,3-氰基-1,4-双[2-氨基苯基硫代]丁二烯(U0126)和孕酮受体抑制剂米非司酮(RU486)对猪颗粒细胞的调控作用本部分实验结果显示,LH和hCG可以显著促进猪颗粒细胞中CEBPβ的表达；并且添加U0126(ERK1/2抑制剂)和RU486(孕酮受体抑制剂)培养颗粒细胞,可以降低其中的p-ERK1/2、EBPβ和p-p38MAPK蛋白的表达。进一步研究发现,U0126和RU486对猪颗粒细胞的作用,不受培养基中FBS的影响；U0126的培养,可以导致猪颗粒细胞周期分布发生显著变化,使S和G2/M期细胞减少,G0/G1期细胞增加,而RU486只是促使猪颗粒细胞S期的细胞减少,其他时期的细胞改变不显著；同时发现,U0126可以抑制颗粒细胞的凋亡,而RU486可以促进颗粒细胞的凋亡；并且U0126和RU486的培养均可以显著降低颗粒细胞培养液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的分泌水平。为了进一步研究U0126和RU486对猪颗粒细胞的作用机制,利用QPCR我们检测了周期、凋亡、激素分泌、排卵及黄体化相关基因的表达,结果发现,U0126添加培养后,bcl-2和bax基因表达基本不变,p53和cyclinAl上调,caspase-3、CYP11Al、Runx2、cyclinBl、PTGFR和IGFBP4表达下调；而RU486培养之后,bcl-2、bax、p53、caspase-3、Runx2、cyclinAl、cyclinBl和PTGFR表达均上调,激素合成相关基因CYP11A1和排卵相关基因IGFBP4表达下调。本部分实验揭示了ERK1/2和PG在猪颗粒细胞中作为重要关键的调控因子,调控着猪颗粒细胞的周期、凋亡、类固醇激素分泌和排卵及黄体化相关基因的表达。实验二：利用RNA干扰技术研究CEBPP在猪颗粒细胞中的作用本部分实验成功构建了CEBPβ干扰质粒,并且筛选出最佳干扰质粒pshRNA-2,在蛋白水平及mRNA水平均可以显著降低CEBPβ的表达。WB结果显示,随着CEBPβ表达的降低,p-ERK1/2的蛋白表达水平显著升高。进一步研究发现,降低CEBPβ的表达可以显著的改变猪颗粒细胞的周期分布,促使S期细胞增加,但是不影响猪颗粒细胞的凋亡；同时显著降低颗粒细胞培养液中类固醇激素的分泌水平。为了进一步揭示CEBPβ对猪颗粒细胞周期、凋亡和激素分泌的作用机制,利用QPCR方法,我们检测了相关基因的表达,结果显示：基因bcl-2(抗凋亡基因)、StAR、Runx2(类固醇激素合成)上调,同时Caspase-3、p53(促凋亡)、CYP11A1(类固醇激素合成)、cyclinAl、cyclinBl和cyclinDl(周期)下调,暗示干扰CEBPβ的表达可能在转录水平上抑制颗粒细胞的凋亡,调控细胞周期和激素分泌。我们还同时检测了猪颗粒细胞中与排卵、颗粒细胞黄体化和卵丘扩展相关基因的表达,结果显示：干扰CEBPβ的表达显著增加了PTGS2的表达,降低了IGFBP4、Has2和PTGFR的表达。结果表明,CEBPβ作为猪颗粒细胞中关键的调控因子,通过调控猪颗粒细胞的生长参与调控猪卵泡排卵及颗粒细胞黄体化的过程。本研究的结果表明,MAPK-CEBPβ通路不仅对猪颗粒细胞凋亡、周期、类固醇激素的分泌均有显著的调控作用,而且影响到众多基因的调控表达,其中包括细胞周期、凋亡、激素分泌调控基因,卵母细胞生长、排卵相关及黄体化相关调控基因。由此可见MAPK-CEBPβ在猪颗粒细胞中起到重要的调控作用,并通过对颗粒的生长及相关基因的调控参与对猪卵母细胞生长、卵泡排卵及颗粒细胞黄体化进程的调控。为研究猪卵泡发育及排卵提供参考依据,为提高猪的繁殖力奠定基础。