二噁英是多氯代二苯并二噁英和多氯代二苯并呋喃的统称,是对人体健康和环境有很大威胁的持久性有机污染物,这些物质在焚烧、纸浆漂白和化学生产等过程中作为副产物产生,并且在环境中稳定存在。与物理化学技术相比,生物降解法成本低,不会产生二次污染,通过生物修复去除二噁英始终是国内外的研究热点,并被认为是未来的发展方向。本文以课题组前期分离获得的一株含两个二噁英降解质粒的红球菌(Rhodococcus sp.strain p52)作为研究对象,对其降解二苯并呋喃(DF)途径中外二醇双加氧酶与水解酶基因的表达及功能进行研究。通过全基因组序列分析发现,该菌株含有两套能够以有角度双加氧方式代谢DF的双加氧酶系统,两套双加氧酶系统分别位于两个不同的质粒上,其编码基因簇分别包含起始双加氧酶基因dfdA和dbfA,外二醇双加氧酶基因dfdB和flnD,水解酶基因dfdC和fnE。本文通过PCR扩增技术分别得到DF降解途径中外二醇双加氧酶基因dfdB和fnD、水解酶基因d 和 flnE,并以 pET-32a(+)为载体,以Escherichia coli DH5α,Escherichia coliBL21(DE3)和Rosetta gamiTM2(DE3)plysS 为宿主菌株,进行基因的克隆及异源表达。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物,结果显示,与同样经过IPTG诱导的含有空载体的宿主菌相比,在连接有目的基因的重组菌株的蛋白质电泳图谱中,均有明显的特异性蛋白条带,其分子量大小与理论预测值相符,且基因dfdB、dfdC和fnE的表达蛋白主要存在于上清液中,以可溶性蛋白的形式存在,而外二醇双加氧酶基因fnD的表达产物以包涵体的形式存在于沉淀中。基于以上研究,本文进一步验证了外二醇双加氧酶DfdB和水解酶DfdC的生物学功能,同时研究了温度、pH、金属离子对外二醇双加氧酶DfdB活性的影响。为获得具有生物活性的目的蛋白,对于外二醇双加氧酶基因flnD的表达产物进行了包涵体的复性研究。以上研究结果表明,外二醇双加氧酶基因dfdB编码开环裂解酶,该酶能够催化2,3-二羟基联苯的开环裂解,产生HPDA,而基因dfdC编码水解酶,该酶能够催化HPDA的水解。在温度为30℃,pH值为8时,外二醇双加氧酶DfdB具有最高生物活性,不同金属离子对酶活性产生不同程度的抑制作用。外二醇双加氧酶基因fnD以包涵体的形式大量表达,经包涵体变性复性后可成为可溶性蛋白,但其生物学功能尚有待进一步验证。综上所述,本研究从分子遗传学角度探究了二噁英的降解机理,为开发利用及改造微生物有效去除二噁英等污染物提供了理论依据,为环境中二噁英等污染物的生物修复打下基础。