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自然环境中存在着许多在重金属胁迫下能正常生长的微生物,如酵母菌、藻类和细菌等。微生物在去除重金属和适应环境的过程中,其细胞内部必定会发生一系列复杂的生理生化反应。本实验以南极酵母(Rhodotorula mucilaginosa)AN5为研究对象,通过Illumina测序技术分析其在Cu2+胁迫下转录组学的变化,从m RNA水平研究南极酵母AN5对重金属的适应机制。对2个显著差异基因开展了进一步研究,包括WD重复蛋白基因的克隆分析和表达纯化,以及谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及序列分析。(1)利用转录组测序技术,对Cu2+胁迫前后的南极酵母AN5转录组进行了测序,对照组共得到41 738 378条读序,实验组得到51 247 104条读序。确认了407个表达差异(2倍变化以上)的基因,其中有305个基因表达上调,102个基因表达下调;通过GO注释对基因进行分类,大部分的unigene被归于生物学过程;对6 414条unigene进行了egg NOG分析,了解基因的功能分布特征;共有3 282个isotig得到了KEGG注释,代谢通路所占比例较大,为32.3%,根据以上分析确认了大量与环境胁迫相关的差异表达基因。(2)在表达差异显著的基因中选取3个基因进行荧光定量PCR实验,包括WD重复蛋白基因、谷胱甘肽硫转移酶基因、热激蛋白90基因。结果表明,在重金属Cu2+胁迫下,基因GST和WD重复蛋白的表达量均呈上调趋势,基因HSP90在4 h和12 h的表达量上调,48 h的表达量下调。GST基因在48 h时表达量显著提高,约是对照组的5倍;HSP90基因在12 h时实验组的表达量显著高于对照组。(3)本实验对南极酵母AN5转录组测序得到的重要差异基因WD重复蛋白基因进行克隆,得到c DNA序列长度为1 079 bp,共编码361个氨基酸。生物信息学分析结果表明,WD重复蛋白的分子量为40.91 k Da,理论等电点为5.25,主要表现为亲水性,即不存在跨膜区也检测不到信号肽序列。在其下游引入His Tag,重组到p ET-28a载体上成功构建相应的表达载体,此外用IPTG对其进行诱导表达,并用亲和层析对目的蛋白进行了纯化。(4)对南极酵母AN5的GST基因进行克隆和序列分析后发现,GST基因的c DNA长度为969 bp,编码氨基酸的数量为284个,蛋白的分子量为32.58 k Da,理论等电点为7.74,亲水性较强,既不存在明显的跨膜区也不是信号肽,二、三级结构预测结果表明该蛋白存在较多的α-螺旋和无规卷曲。以上研究以期为理解南极酵母菌对重金属的抗性机制提供一些参考。