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研究背景浸润在肿瘤病变组织中的所有巨噬细胞统称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。肿瘤中TAM的大量存在往往与肿瘤转移、血管生成增加和预后不良有关。目前针对TAM的肿瘤治疗策略包括清除TAM和TAM的再极化已取得一定进展,寻找出了多个靶点。但是针对这些靶点的策略缺乏特异性或存在严重的副作用,影响了进一步的临床研究和应用。因此,靶向TAM的治疗需要寻找新的特异性靶点。Galectin-3属于凝集素家族,对β-半乳糖苷具有高度的亲和力,参与了巨噬细胞多种生物学活动,如迁移、凋亡、吞噬和粘附等。近年来研究表明,在肿瘤组织缺氧区域中galectin-3高表达,而远离此区域的galectin-3表达水平降低。TAM也常常在肿瘤的缺氧区域聚集,获得促肿瘤的特性。这提示肿瘤缺氧微环境中,galectin-3有可能在TAM中表达并参与TAM的促肿瘤作用。那么通过靶向galectin-3干扰缺氧区域中TAM的生存或功能,进而抑制肿瘤的发展,将会是很有潜力的治疗策略。研究目的本论文旨在研究肿瘤缺氧微环境中,galectin-3参与TAM促肿瘤作用的机制及galectin-3抑制剂靶向TAM抗乳腺癌转移作用。具体分为三章内容:1)采用体内以及体外实验考察肿瘤微环境对TAM中galectin-3表达的影响以及调节机制,并研究galectin-3在TAM中的促肿瘤迁移以及血管生成作用。2)采用体内以及体外实验评价galectin-3抑制剂改性柑橘果胶（MCP）对TAM的存活以及极化作用。3)研究抗血管生成药贝伐单抗对乳腺癌组织缺氧以及TAM浸润的影响,采用体内模型评价联合应用MCP提高贝伐单抗抗肿瘤作用的效果和可行性。一、缺氧微环境中TAM高表达和分泌galectin-3促进乳腺癌转移的机制研究研究目的:揭示肿瘤缺氧微环境对TAM中galectin-3表达的影响及调节机制,并研究galectin-3参与TAM的促肿瘤作用。研究方法:本研究采用人单核细胞系THP-1细胞经IL-4/IL-13诱导分化的M2型巨噬细胞以及人乳腺癌细胞系MDA-MB-231条件培养基（CM）诱导分化的乳腺癌相关巨噬细胞TAM为体外实验的研究对象,体内模型采用小鼠乳腺癌4T-1细胞原位接种模型。1)巨噬细胞的极化与鉴定:流式细胞术检测M2细胞和TAM细胞表面抗原的表达;采用transwell共培养以及CM共孵育的方法比较常氧与缺氧条件下M2细胞、TAM对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、转移和血管形成的作用。2)通过建立化学缺氧模型以及物理缺氧模型观察galectin-3在TAM中的蛋白表达、mRNA表达、分泌情况。3)通过siRNA技术干扰galectin-3的表达研究galectin-3是否参与缺氧TAM的促肿瘤迁移、以及血管生成作用。4)通过细胞培养基中外加重组人galectin-3蛋白观察分泌出的galectin-3对HUVECs外泌体的蛋白表达及促肿瘤细胞粘附、迁移功能的影响。5)分别采用多种候选蛋白的抑制剂或激活剂研究缺氧环境下galectin-3在TAM中的表达调节机制。6)采用BALB/c小鼠乳腺癌原位癌模型研究缺氧TAM与galectin-3的关系。结果:1)首先,流式细胞仪检测结果显示,经CM诱导的TAM表达了M2巨噬细胞的细胞表面抗原CD68和CD163。此外,MTT、transwell、小管形成实验的结果显示与常氧环境相比,缺氧环境下TAM促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及HUVECs的血管生成的作用更强。2)Western blot、RT-PCR、ELISA以及免疫荧光实验结果显示缺氧可促进M2、TAM中galectin-3的mRNA、蛋白表达以及galectin-3的分泌。3)通过siRNA技术干扰galectin-3表达和共孵育模型发现TAM一方面通过分泌galectin-3促进MDA-MB-231细胞增殖、转移、血管拟态,HUVECs细胞的血管形成,另一方面TAM细胞内高表达的galectin-3参与了 TAM对葡萄糖的摄取以及VEGF的分泌。4)Westernblot、RT-PCR、粘附实验以及transwell实验的结果显示外源性的galectin-3可促进HUEVC外泌体中的粘附蛋白ICAM-1的表达,并促进了肿瘤细胞MDA-MB-231的粘附和迁移;Galectin-3对ICAM-1的表达上调可能是与galectin-3引起的糖酵解水平升高及促进HIF-1α入核有关。5)在TAM表达和分泌galectin-3的分子机制研究方面,Western blot、RT-PCR以及免疫荧光实验的结果显示AKT、HIF-1α、AMPK并不是调节缺氧TAM中galectin-3表达的关键蛋白,缺氧诱导的TAM内galectin-3高表达主要是由缺氧引起的ROS水平升高进而引起NF-κB入核,促进galectin-3的基因转录造成的。6)体内实验结果显示,间歇式低氧处理BALB/c小鼠可显著促进原位乳腺癌组织局部的TAM浸润及galectin-3的表达,进而瘤内血管形成、肿瘤转移增加,而这种促进作用可被galectin-3抑制剂改性柑橘果胶抑制。结论:缺氧微环境中TAM通过表达和分泌galectin-3促进肿瘤的进展,galectin-3可作为靶向TAM治疗的潜在靶点。二、改性柑橘果胶（MCP）抑制TAM发挥抗肿瘤转移作用的研究研究目的:第一部分的研究已经证实缺氧中的TAM细胞内高表达和分泌galectin-3。这部分将以galectin-3的抑制剂MCP为研究对象,考察MCP对TAM增殖、分化的影响以及对抗其促乳腺癌转移作用。研究方法:采用人单核细胞系THP-1,经IL-4/IL-13诱导分化的M2巨噬细胞为体外实验的研究对象,体内模型分别采用小鼠乳腺癌4T-1细胞原位模型以及小鼠乳腺癌4T-1肺转移模型。1)观察不同浓度的MCP在常氧以及缺氧环境下对TAM细胞存活的抑制作用。2)观察不同浓度的MCP对M2型巨噬细胞表面特异性蛋白的影响。3)实时荧光定量PCR方法检测不同浓度的MCP对巨噬细胞M2型标志基因的mRNA水平的影响。4)通过siRNA技术干扰galectin-3的表达,结合特异性抑制剂分子考察MCP的作用机制。5)采用TAM与乳腺癌MDA-MB-231细胞的transwell共孵育模型,以及TAM条件培养基与MDA-MB-23 1或HUVECs共孵育模型检测MCP对TAM促肿瘤细胞增殖、迁移、血管拟态以及血管新生功能的影响。6)采用小鼠乳腺癌4T-1细胞原位接种模型以及小鼠乳腺癌4T-1肺转移模型,检测MCP对瘤内TAM的影响及抗乳腺癌转移作用。7)采用氯膦酸二钠脂质体清除小鼠体内巨噬细胞进一步确认MCP可通过抑制TAM而发挥抗肿瘤生长和转移。研究结果:1)CCK-8结果显示,MCP可浓度依赖性地抑制TAM的存活。与常氧环境相比,在缺氧环境中MCP对TAM的生存抑制作用更强。2)机制方面,结果发现MCP通过抑制GULT-1转录和表达,进而抑制TAM细胞对葡萄糖的摄取,最后削弱了 TAM在缺氧环境下的存活。3)流式细胞术以及RT-PCR结果显示,MCP可明显抑制M2极化,而不影响M1极化。4)Transwell以及小管形成实验结果显示,MCP可抑制TAM的促肿瘤细胞迁移、血管拟态以及血管新生功能。5)在4T1原位癌和转移瘤模型中,MCP可降低瘤组织及肺转移灶中TAM的数量。同时,MCP可显著抑制原位癌的生长和肺转移结节数目。6)采用氯膦酸二钠脂质体清除小鼠体内巨噬细胞后,MCP对肿瘤生长和转移的抑制作用显著下降。研究结论:MCP在体内外均能显著抑制TAM的存活与极化状态,从而抑制乳腺癌的生长和转移。三、MCP合用抗血管生成药贝伐单抗发挥协同抗乳腺癌作用研究目的:抗血管生成药被报道会加重肿瘤组织内缺氧,促进TAM的浸润,从而促进肿瘤发展。第二部分的研究已经证实MCP可抑制TAM,尤其对缺氧区域中的TAM效果更好。这部分采用小鼠乳腺癌模型评价抗血管生成药贝伐单抗联合应用MCP提高抗肿瘤作用的可行性。研究方法:1)建立BALB/c乳腺癌原位癌模型,观察贝伐单抗对肿瘤组织缺氧、TAM浸润以及galectin-3的表达的影响。2)观察MCP与贝伐单抗合用对肿瘤增殖和转移的影响。研究结果:1)免疫组化以及ELISA等结果显示与对照组相比,贝伐单抗组小鼠肿瘤内的缺氧、TAM数量、血管生成和galectin-3的表达以及血清中的galectin-3均增加。2)通过测量瘤体积、称瘤重以及小动物活体成像仪检测荧光标记的乳腺癌细胞在小鼠体内的生长和转移,结果发现MCP与贝伐单抗合用可增强贝伐单抗的抗肿瘤增殖和转移作用。研究结论:贝伐单抗可促进肿瘤中TAM的浸润以及galectin-3的表达,而MCP则可通过抑制TAM协同贝伐单抗发挥抗肿瘤作用。