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一、研究背景:
肿瘤是威胁人类生命和健康的主要疾病,目前已成为继心血管疾病后的第二号杀手。手术、放射和化学治疗是癌症的三种主要治疗方法,但其中一半的病人需要接受化学治疗,对药物原发和继发耐药仍然是肿瘤有效治疗的主要障碍。多种机制参与肿瘤细胞耐药性的形成,其中ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters,ABC转运蛋白)的表达是多药耐药(multidrug resistance,MDR)产生的主要原因。最近肿瘤干细胞假说认为肿瘤细胞内的一小群干细胞样细胞是肿瘤耐药和复发的根源,为克服肿瘤多药耐药提供了一个新的研究方向。
克服肿瘤多药耐药主要有两种途径:寻找高效、低毒对抗癌药物药代动力学无影响的MDR逆转剂;开发对肿瘤MDR细胞不具抗药性的新型抗癌药物。
海洋生物生活在高盐、高压、缺氧、缺阳光这一特殊环境,在其生长和代谢过程中产生并积累了大量具有特殊化学结构、生理活性和功能的物质,随着天然产物分离、纯化和结构鉴定技术的快速发展,海洋产品已成为新药开发的重要源泉。
本研究筛选了132个海洋红树林内生真菌代谢产物的抗肿瘤活性,并研究了其中高效抗肿瘤活性黑麦酮酸D的抗肿瘤机理。
二、方法:
MTT法测定化合物对多种人类肿瘤细胞包括ABC转运蛋白高表达的多药耐药细胞的细胞毒活性;化合物与DNA的相互作用使用DNA嵌入实验检测;PI单染分析细胞周期;Western blotting或流式细胞仪免疫荧光测定蛋白的表达;双荧光染色并叠加观察蛋白在细胞浆与核细胞内的分布;半定量RT-PCR测定mRNA的表达水平;化学合成的双链小片段siRNA,Lipofectin2000转染到细胞内干扰靶基因的表达;蛋白的turnover实验观察化合物对蛋白降解的影响;Hoechst33342染色,MoFlo流式细胞仪测定SP细胞的比例和分选目的细胞群;肿瘤干性细胞的球囊培养使用含有相应生长因子的无血清培养基。
三、结果:
1、筛选了132个海洋红树林内生真菌代谢产物,得到18个具有抗肿瘤活性的化合物,其中化合物7、8、9、12、14、15、19对ABCB1过表达的KBv200和MCF-7/adr细胞不敏感,提示它们可能是ABCB1的底物,而化合物1、100、104、116、120、125、126、127和128对MDR细胞却表现出了高效的细胞毒作用,具有作为先导化合物开发的前景。以人正常肝细胞LO2对照,化合物8、9、14和19对肿瘤细胞显示了更强的细胞毒活性。所分离的60个香豆素衍生物和13个稠环类化合物没有发现抗肿瘤的活性。结构活性分析显示了羟基在化合物在抗肿瘤活性中起关键作用,DNA嵌入实验显示所分离的抗肿瘤活性化合物不与DNA相互作用。
2、MTT细胞毒筛查显示海洋红树林内生真菌代谢产物黑麦酮D(SAD)对ABCB1、ABCC1和ABCG2过表达的MDR细胞都表现出了高效的细胞毒活性。PI单染细胞周期分析显示SAD可使S1和S1-M1-80细胞阻滞在G2/M期,作用0、12、24、48、72小时后,S1细胞细胞周期的G2/M期从11.96±1.35%上升为25.38±5.02、30.13±2.35、34.01±2.75和44.73±3.27%,S1-M1-80细胞细胞周期的G2/M期从13.47±0.97%上升为20.11±1.77、26.77±2.34、34.17±1.99和36.43±2.76%。SAD可抑制细胞ERK、AKT、P38信号转导通路,其下游的β-catenin、GSK蛋白也发生了相应的减少,激活细胞的JNK通路磷酸化下游的c-jun,在蛋白水平上调c-jun蛋白,而AP-1转录因子家族的其它成员例如c-fos和ATF2未见升高。Western blot和免疫荧光染色的结果都显示了细胞核中c-Jun蛋白的聚集,RNA干扰c-Jun后部分抑制了SAD所引起的细胞死亡,说明升高的c-jun蛋白可部分解释SAD的细胞毒作用。RT-PCR的结果显示SAD不能上调c-Jun mRNA的表达,接着使用放线菌酮阻滞细胞蛋白的合成,观察SAD对c-Jun蛋白降解的影响,发现SAD抑制了c-Jun蛋白的降解。
SAD对A549、Glc-82和H460三株肺癌细胞的半数抑制浓度分别为0.301±0.025、0.264±0.024、0.108±0.015μmol/L。分离上述三株肺癌细胞的SP亚群细胞,发现SP细胞较non-SP细胞有较高的增殖能力和无血清培养基中球囊性生长的能力。MTT细胞毒实验显示SAD对肺癌的SP细胞没有表现出耐药性,而传统化疗药物阿霉素和顺铂则对SP细胞耐药2~3倍。SAD可以降低肺癌细胞SP亚群的比例,SAD作用48小时后,A549 SP亚群从27.85±3.42%减少到16.08±2.55%,Glc-82 SP亚群从18.36±2.17%减少到11.42±2.11%,H460 SP亚群从7.65±0.92%减少到4.13±0.33%。流式细胞仪免疫荧光检测显示SP细胞高表达ABCG2蛋白,与non-SP细胞比较,A549、Glc-82和H460细胞SP亚群中ABCG2的比例分别升高了6.54、6.32倍和5.49倍。SAD处理ABCG2高表达的S1-M1-80细胞后,western blot检测显示SAD可以剂量和时间依赖性的降低ABCG2蛋白的表达,但RT-PCR分析显示SAD并不能影响ABCG2 mRNA的表达。随后的ABCG2蛋白半衰期分析显示SAD加快了ABCG2蛋白的降解,使ABCG2蛋白的半衰期从54.1减少到36.8小时,蛋白turnover实验显示calpain蛋白降解系统参与了SAD对ABCG2的下调。
四、结论:
1、筛选了132个海洋红树林内生真菌来源化合物,其中18个化合物显示了抗肿瘤活性,并且它们都不是作用于DNA产生抗肿瘤作用。
2、黑麦酮D对不同的MDR细胞显示了高效的细胞毒活性,可将细胞阻滞在G2/M期,并抑制肿瘤细胞赖以生存的ERK、AKT、P38信号转导通路,激活细胞的JNK通路磷酸化下游的c-jun,在蛋白水平上调c-jun蛋白,c-jun蛋白的上调可部分解释SAD的细胞毒作用。
3、黑麦酮D不仅对肺癌细胞而且对肺癌SP亚群细胞都显示了高效的细胞毒活性,SAD可降低肺癌细胞中SP的比例。SP细胞高表达ABCG2蛋白,而SAD可以在蛋白水平下调ABCG2蛋白的表达,SAD加速ABCG2蛋白的降解是其作用于SP细胞的可能机制。