【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨TNF-α诱导结肠癌细胞CXCL10/CXCR3轴表达上调的分子机制及其在结肠癌中的功能,明确TNF-α介导的慢性炎症是否通过诱导趋化因子CXCL10的表达,协同增强EMT介导的结肠癌转移,阐明CXCL10/CXCR3轴在结肠癌发展中的调节方式,为寻找新的靶点抑制结肠癌转移奠定基础。方法:利用GEPIA和人类蛋白图谱数据库搜集相关临床数据,分析CXCL10/CXCR3在人结肠癌
【基金项目】
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国自然基金国家重点研发计划项目（2018YFC1313400）； 陆军军医大学科技创新提升工程项目（2019CXJSB017和2019XYY21）；
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目的:本研究旨在探讨TNF-α诱导结肠癌细胞CXCL10/CXCR3轴表达上调的分子机制及其在结肠癌中的功能,明确TNF-α介导的慢性炎症是否通过诱导趋化因子CXCL10的表达,协同增强EMT介导的结肠癌转移,阐明CXCL10/CXCR3轴在结肠癌发展中的调节方式,为寻找新的靶点抑制结肠癌转移奠定基础。方法:利用GEPIA和人类蛋白图谱数据库搜集相关临床数据,分析CXCL10/CXCR3在人结肠癌中的表达情况;利用qPCR和ELISA检测TNF-α刺激结肠癌细胞后CXCL10在m RNA和蛋白水平的变化情况;利用WB实验检测TNF-α激活结肠癌相关通路情况;利用荧光素酶报告基因实验检测CXCL10与转录因子p65的结合程度;通过细胞划痕和Transwell实验分别检测CXCL10对结肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响;利用WB,qPCR和免疫荧光检测CXCL10诱导结肠癌EMT相关标志物变化和相关通路激活情况;通过皮下成瘤,Ki-67和肺转移等免疫组化实验检测CXCL10在体内对结肠癌的成瘤和侵袭浸润能力。结果:1.通过GEPIA数据库分析显示,CXCL10基因在结肠癌中显著过表达;从人类蛋白图谱中收集的临床标本数据分析显示,其受体CXCR3在结肠癌组织中高表达,在正常肠道组织低表达,CXCR3低表达患者的生存率明显高于CXCR3高表达患者,提示结肠癌患者CXCR3高表达与较长生存率呈负相关;进一步通过GEPIA数据库分析显示,TNF-α与CXCL10在结肠癌组织中表达量呈正相关,而在正常组织无相关联系。2.利用qPCR、ELISA和WB等分子实验,通过抑制相关通路证实TNF-α可以刺激结肠癌细胞SW480和SW620高表达CXCL10,此外,TNF-α通过激活p38MAPK,PI3K/Akt两条平行信号支路后,刺激下游NF-κB通路p65的入核磷酸化激活CXCL10的转录。3.利用荧光素酶报告基因实验,通过构建并转染p65过表达质粒和p65定点突变CXCL10启动子报告基因质粒证实TNF-α可以激活NF-κB通路p65转录因子与CXCL10启动子相关位点结合,启动CXCL10转录。4.利用细胞划痕和Transwell实验表明CXCL10可以增强SW620和SW480的迁移、侵袭能力,而干扰其受体CXCR3后,CXCL10对结肠癌细胞的迁移促进作用减弱;利用Pull down下拉实验证实CXCL10可以激活Rho A,cdc42等在肿瘤细胞迁移、侵袭中起关键作用的小GTPase家族。5.利用qPCR,WB,免疫荧光实验表明CXCL10可以诱导结肠癌发生EMT,其中EMT上皮标志物E-cad在m RNA和蛋白水平表达下调,N-cad、Vimentin、Fibronectin等间质标志物在m RNA和蛋白水平表达上调。利用WB实验证实CXCL10/CXCR3轴可通过活化PI3K/Akt,使GSK-3β磷酸化失活,导致Snail表达上调,进而调控结肠癌细胞发生EMT。6.通过将构建的CXCL10过表达结肠癌细胞CXCL10-SW480和CXCL10-SW620以及对照组SW480,Vector-SW480,SW620,Vcetor-SW620细胞皮下注射小鼠体内,利用皮下成瘤,Ki-67和肺转移等免疫组化实验证实CXCL10可以提升体内结肠癌细胞的成瘤和肺转移能力,加速结肠癌细胞的恶性程度。结论:本研究证实肿瘤微环境中的关键炎性介质TNF-α通过p38 MAPK,PI3K/Akt和NF-κB通路诱导CXCL10表达,作用于高表达CXCR3的自身结肠癌细胞,增强其体内外迁移和侵袭能力,并通过PI3K/Akt/GSK-3β/Snail通路诱导结肠癌发生EMT。
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