[背景和目的]:肺癌是危害人类健康的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率位居各种恶性肿瘤的前列,肺癌的病理类型包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。在非小细胞肺癌中,肺腺癌又是其主要病理类型之一,其总生存率低,且近年来发病率呈逐渐升高的趋势。尽管肺癌的研究有较大的进展,但由于其侵袭的生物学性状和高度异质性,其发病机制至今尚未完全阐明。MicroRNAs（miRNAs）,一类长度约为23碱基的内源性非编码小RNA,可以通过碱基互补配对的原则与靶基因mRNA结合从而抑制靶基因的转录过程。目前,已经有很多研究报道证实miRNA在生物学过程中起到了重要的作用。作为miRNA家族成员之一,miR-516a-3p被发现在多种肿瘤中存在差异性表达,而且与肿瘤的发生发展关系密切。然而有关miR-516a-3p在肺腺癌中的作用机制却鲜见报道。受体型酪氨酸蛋白激酶 D（Receptor-type tyrosine-protein phosphatase δ,PTPRD）是近年来被研究者广发关注的肿瘤靶点。研究发现PTPRD在多种肿瘤中表达下调,扮演着抑癌基因的角色。结合本课题组前期的研究基础,我们发现miR-516a-3p在肺腺癌中表达上调,而PTPRD在肺腺癌表达下调,利用生物信息学预测发现miR-516a-3p与PTPRD mRNA3’端非翻译区存在碱基互补配对的序列,我们推测两者之间可能会存在某种生物学关系,从而影响肿瘤发生发展的过程。在本研究中,我们主要目的包括:检测miR-516a-3p及PTPRD在肺腺癌组织及细胞中的表达并分析其与临床病理特征的相关性;研究miR-516a-3p对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移以及凋亡的影响并探讨相关机制;验证PTPRD是否是miR-516a-3p的直接靶基因并探讨miR-516a-3p靶向PTPRD的相关机制;观察miR-516a-3p对裸鼠成瘤能力的影响。我们拟通过上述实验初步阐明miR-516a-3p通过靶向PTPRD在肺腺癌中作用及其机制。第一部分:miR-516a-3p和PTPRD在肺腺癌中的表达及其与患者临床病理特征的相关性研究[目的]:检测miR-516a-3p及PTPRD在肺腺癌组织与细胞中的表达情况,同时收集临床样本资料,分析miR-516a-3p及PTPRD与临床病理特征的相关性。[方法]:（1）qPCR验证miR-516a-3p及PTPRD在肺腺癌组织与细胞中的表达情况,探究miR-516a-3p及PTPRD与临床病理特征的关系,Spearman相关性分析探究miR-516a-3p与PTPRD表达的相关性。（2）starBase及KM plotter数据库分析PTPRD在肺腺癌中的表达及其与肺腺癌患者预后的关系。[结果]:（1）与配对肺正常组织相比,miR-516a-3p在肺腺癌组织中高表达,而PTPRD在肺腺癌组织中低表达,二者的表达水平呈负相关（R=-0.4926,P=0.0002）。（2）与正常支气管上皮细胞相比,miR-516a-3p在肺腺癌细胞中高表达,而PTPRD在肺腺癌细胞中低表达,与组织中表达情况一致。（3）miR-516a-3p的表达水平与肺腺癌患者性别、年龄、吸烟状态、肿瘤大小及淋巴结是否转移无明显相关性,但与TNM分期相关,miR-516a-3p表达与TNM分期呈正相关。（4）PTPRD的表达水平与肺腺癌患者性别、年龄、吸烟状态、肿瘤大小及淋巴结是否转移无明显相关性,但与TNM分期相关,PTPRD表达与TNM分期呈负相关。（5）starBase分析发现与肺正常组织相比,PTPRD在肺腺癌组织中低表达。KM plotter 分析发现 PTPRD 高表达患者的 OS（HR=0.7,p=2.2x10-8）及 PFS（HR=0.79,p=0.013）更长。[结论]:与肺正常组织及正常支气管上皮细胞相比,miR-516a-3p在肺腺癌组织及细胞中高表达,而PTPRD在肺腺癌组织及细胞中低表达,两者在组织水平的表达呈负相关。miR-516a-3p及PTPRD的表达水平与肺腺癌患者性别、年龄、吸烟状态、肿瘤大小及淋巴结是否转移无明显相关性,但均与TNM分期相关,miR-516a-3p表达与TNM分期呈正相关,而PTPRD表达与TNM分期呈负相关。第二部分 miR-516a-3p对肺腺癌细胞株H1299、SPC-A1生物学行为的影响及其机制的初步探究[目的]:探讨上调和下调miR-516a-3p对肺腺癌细胞株H1299、SPC-A1增殖,迁移,侵袭及凋亡的影响。并初步探究miR-516a-3p调控肺腺癌细胞生物学行为的机制。[方法]:（1）将 miR-516a-3p inhibitor 及 miR-516a-3p mimics 转染至肺腺癌细胞H1299、SPC-A1,通过qPCR和荧光显微镜测定转染效率,对转染成功的肺腺癌细胞进行增殖,迁移,侵袭及凋亡的检测。（2）利用 miR-516a-3p inhibitor 及 miR-516a-3p mimics 上调和下调 miR-516a-3p,通过Western blot检测肺腺癌细胞中STAT3、p-STAT3、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax及MMP-9蛋白的表达情况。[结果]:（1）转染 miR-516a-3p inhibitor 及 miR-516a-3p mimics 后,肺腺癌细胞H1299、SPC-A1中miR-516a-3p被成功的下调和上调。（2）下调miR-516a-3p能够抑制肺腺癌细胞H1299、SPC-A1的增殖能力;上调miR-516a-3p能够促进肺腺癌细胞H1299、SPC-A1的增殖能力。（3）下调miR-516a-3p能够抑制肺腺癌细胞H1299、SPC-A1的迁移和侵袭能力;上调miR-516a-3p能够促进肺腺癌细胞H1299、SPC-A1的迁移和侵袭能力。（4）下调miR-516a-3p能够促进肺腺癌细胞H1299、SPC-A1的凋亡;上调miR-516a-3p能够抑制肺腺癌细胞H1299、SPC-A1的凋亡。（5）下调miR-516a-3p能够抑制肺腺癌细胞中p-STAT3的表达,上调miR-516a-3p能够促进肺腺癌细胞中p-STAT3的表达;而上调和下调miR-516a-3p对肺腺癌细胞中STAT3的表达影响无明显统计学意义。（6）下调miR-516a-3p能够促进凋亡诱导蛋白Bax、Cleaved-caspase3的表达,并抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达;上调miR-516a-3p对Bax、Cleaved-caspase3及Bcl-2蛋白表达的影响无明显统计学意义。（7）下调miR-516a-3p能够抑制肺腺癌细胞中MMP-9的表达,上调miR-516a-3p能够促进肺腺癌细胞中MMP-9的表达。[结论]:下调miR-516a-3p能够抑制肺腺癌细胞H1299、SPC-A1增殖,迁移和侵袭,并促进其凋亡。上调miR-516a-3p能够促进肺腺癌细胞H1299、SPC-A1增殖,迁移和侵袭,并抑制其凋亡。说明miR-516a-3p很可能在肺腺癌中起到了促癌的作用。miR-516a-3p影响肺腺癌细胞生物学行为的机制可能是通过调控p-STAT3、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax 及 MMP-9 蛋白的表达实现的。第三部分 miR-516a-3p靶向PTPRD在肺腺癌中机制的研究[目的]:预测并验证PTPRD是否为miR-516a-3p的直接靶点。验证在下调miR-516a-3p的基础上再下调PTPRD能否部分或完全逆转下调miR-516a-3p对肺腺癌细胞生物学功能的影响。[方法]:（1）生物信息学对miR-516a-3p的靶基因进行预测,选择PTPRD作为其候选靶基因。（2）qPCR及WB检测上调和下调miR-516a-3p对靶基因PTPRD mRNA及蛋白表达水平的影响。（3）通过双荧光素酶报告基因实验进一步验证PTPRD是否是miR-516a-3p直接靶基因。（4）利用小干扰RNA技术构建PTPRD低表达细胞株,通过qPCR和WB测定转染效率。（5）验证在下调miR-516a-3p的基础上再下调PTPRD能否部分或完全逆转下调miR-516a-3p对肺腺癌细胞增殖,迁移,侵袭及凋亡的影响。（6）验证在下调miR-516a-3p的基础上再下调PTPRD能否部分或完全逆转下调 miR-516a-3p 对肺腺癌细胞中 p-STAT3、MMP-9、Cleaved-caspase3、Bcl-2及Bax蛋白表达水平的影响。[结果]:（1）生物信息学分析发现PTPRD是miR-516a-3p潜在靶基因。（2）下调miR-516a-3p能够促进肺腺癌细胞中PTPRD mRNA及蛋白的表达,上调miR-516a-3p能够抑制肺腺癌细胞中PTPRD mRNA及蛋白的表达。（3）双荧光素酶报告基因实验证实了 PTPRD是miR-516a-3p直接靶基因。（4）在下调miR-516a-3p的基础上再下调PTPRD,能够部分恢复下调miR-516a-3p对肺腺癌细胞中PTPRD表达的影响。（5）在下调miR-516a-3p的基础上再下调PTPRD,能够部分恢复下调miR-516a-3p对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用。（6）在下调miR-516a-3p的基础上再下调PTPRD,能够部分恢复下调miR-516a-3p对肺腺癌细胞凋亡的促进作用。（7）在下调miR-516a-3p的基础上再下调PTPRD,能够部分恢复下调miR-516a-3p 对肺腺癌细胞中 p-STAT3、MMP-9、Cleaved-caspase3、Bcl-2 及Bax蛋白表达的影响。[结论]:PTPRD是miR-516a-3p直接靶基因。miR-516a-3p可能通过直接靶向PTPRD 调控 p-STAT3、MMP-9、Cleaved-caspase3、Bcl-2 及 Bax 蛋白的表达影响肺腺癌细胞的生物学行为。第四部分miR-516a-3p影响肺腺癌细胞增殖体内机制的研究[目的]:通过体内实验观察上调和下调miR-516a-3p对肺腺癌细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况的影响。[方法]:（1）将miR-516a-3p antagomir,miR-516a-3p agomir及NC转染至肺腺癌细胞H1299,通过qPCR测定转染效率,并采用皮下植瘤的方式建立肺腺癌裸鼠模型。（2）每三天观察并测量裸鼠体重及瘤体的大小,3周之后将其处死,称重并拍照。（3）利用qPCR及免疫组化检测PTPRD在各组裸鼠瘤体中的表达情况。[结果]:（1）miR-516a-3p agomir组裸鼠皮下瘤体体积明显大于NC组,而miR-516a-3p antagomir组裸鼠皮下瘤体体积明显小于NC组。（2）miR-516a-3pagomir组裸鼠皮下瘤体重量明显大于NC组,而miR-516a-3p antagomir组裸鼠皮下瘤体重量明显小于NC组。（3）qPCR及免疫组化检测结果显示miR-516a-3p agomir组中PTPRD的表达明显低于NC组,而miR-516a-3p antagomir组中PTPRD的表达明显高于NC组。[结论]:上调miR-516a-3p能够促进肺腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力并抑制PTPRD的表达,下调miR-516a-3p能够抑制肺腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力并促进PTPRD的表达。