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垂体腺瘤发病率高,是常见的颅内肿瘤,大多数腺瘤被认为是良性的,经药物治疗、手术治疗或辅助放射治疗等常规治疗方法可获得痊愈,但仍有一部分垂体腺瘤患者因术后复发或残瘤再生长,难以治愈,严重者预后差,甚至危及生命。大约35%的垂体腺瘤在影像学上表现为侵袭性生长,2017年6月出版的WHO垂体肿瘤新分类取消了既往认为容易复发的“非典型垂体腺瘤”的分类,在描述中将肿瘤增殖(Ki-67指数和有丝分裂计数)和肿瘤侵袭行为作为预测临床预后的重要因素。目前,关于侵袭性垂体腺瘤的诊断尚未形成共识,仅在影像学上利用Hardy分类、改良Hardy分类和Knosp分类等分级系统来评估垂体腺瘤的侵袭性,对垂体腺瘤侵袭性行为的认识和预测仍然是一个挑战。垂体腺瘤的发生发展包括外在因素和内在因素,目前研究表明,家族性垂体综合征有明确的基因缺陷,但绝大多数垂体腺瘤为散发性腺瘤。据报道,散发性垂体腺瘤发生基因组和表观遗传异常会自引起分泌和旁分泌信号,以及细胞周期调节、信号转导、转录调节因子和miRNAs的改变,肿瘤抑制因子异常丢失,癌基因的过度表达,细胞周期的失调和细胞增殖的促进而发生转化。既往文献研究表明,侵袭性的分子基础非常复杂,涉及多种基因,蛋白质和信号通路,再加上垂体腺瘤的亚型分泌的激素在很多方面都不同,垂体腺瘤的发生进展机制有待于进一步阐明。长链非编码RNA(LncRNAs)转录自至少75%的人类基因组,它们在基因调控和维持基因组稳定性方面发挥重要作用并影响各种细胞过程,包括生存、增殖和迁移,有研究发现在零细胞腺瘤中LncRNA c5orf66-as1的表达低于正常垂体组织,侵袭性腺瘤中LncRNA c5orf66-as1的表达低于非侵袭性腺瘤,表明LncRNA c5orf66-as1抑制了垂体腺瘤的发展和侵袭。还有文献表明在非功能性垂体腺瘤中,侵袭性腺瘤与非侵袭性腺瘤相比增殖细胞核抗原的mRNA与meg3-LncRNA水平呈负相关,meg3和hotair的表达可能与非功能性垂体腺瘤的发展和侵袭有关。另外还有文献报道生长激素细胞腺瘤的侵袭与LncRNA H19水平呈正相关。目前,LncRNA PVT1对多种肿瘤的增殖、侵袭、转移具有促进作用,被认为是一种促癌基因,然而其对垂体腺瘤的增殖、侵袭转移的作用尚未见报道。为了深入研究LncRNA PVT1在垂体腺瘤的增殖、侵袭转移的作用与机制,本研究首先对垂体腺瘤术后复发的危险因素进行分析,然后利用垂体腺瘤临床组织标本和垂体腺瘤细胞系来检测侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织标本、垂体腺瘤细胞系GH3和HP75中PVT1表达水平,实验研究PVT1对垂体腺瘤细胞系GH3和HP75生长增殖、克隆形成能力和侵袭迁移能力以及PVT1对β-连环蛋白、C-myc和细胞周期蛋白D1等标志物表达的影响。本研究基于LncRNA PVT1在侵袭性垂体腺瘤中的作用,以期为垂体腺瘤的研究提供了理论基础和新的靶点。研究内容与方法:第一部分垂体腺瘤术后复发的危险因素分析1.收集从2015年8月至2017年8月在陆军特色医学中心大坪医院神经外科首次接受手术治疗的垂体腺瘤121例,平均随访19.59±15.57月,根据复发或残瘤生长分为未复发组和复发组,使用单因素分析和多因素logistic回归分析,探讨性别、年龄、肿瘤体积、肿瘤最大径、肿瘤增殖能力指标、病理类型、手术方式、切除程度对垂体腺瘤术后复发的影响。第二部分LncRNA PVT1在侵袭性垂体腺瘤组织和垂体腺瘤细胞中表达水平变化1.垂体腺瘤组织收集:2017年7月至2018年7月从陆军特色医学中心大坪医院神经外科接受神经内镜经鼻蝶手术治疗的垂体腺瘤患者中,收集到36例侵袭性垂体腺瘤组织,50例非侵袭性垂体腺瘤组织。另备两个垂体腺瘤细胞株(GH3和HP75)以及正常细胞株NHPG细胞。采用qRT-PCR分析垂体腺瘤组织、垂体腺瘤细胞株和正常细胞株的PVT1相对表达水平。第三部分LncRNA PVT1对垂体腺瘤细胞的增殖、成瘤、迁移的作用1.构建pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2载体,以空白载体为对照,将HP75和GH3细胞转染后,确认其转染效率以及PVT1表达水平抑制效率,将pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2及空白质粒转染HP75和GH3细胞,采用MTT法检测细胞增殖情况、用平板克隆法检测HP75和GH3细胞的克隆形成能力、用Transwell侵袭实验检测HP75和GH3细胞的侵袭迁移能力。第四部分PVT1对垂体腺瘤细胞β-连环蛋白、c-myc、细胞周期蛋白D1以及细胞间质转化标志蛋白表达水平的作用1.采用Western blotting检测在侵袭性垂体腺瘤组织和非侵袭性垂体腺瘤组织中Wnt/β-连环蛋白信号通路相关分子β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc表达水平。2.采用Western blotting检测在垂体腺瘤细胞HP75和正常细胞NHPG中Wnt/β-连环蛋白信号通路相关分子β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc表达水平。3.将sh-PVT1质粒和空白对照转染垂体腺瘤细胞HP75和GH3,采用Western blotting检测垂体腺瘤细胞HP75和GH3中Wnt/β-连环蛋白信号通路相关分子β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc表达水平。4.将sh-PVT1质粒和空白对照转染垂体腺瘤细胞HP75和GH3,采用Western blotting检测了垂体腺瘤细胞HP75和GH3中E-cadherin和N-cadherin分子表达水平,研究PVT1对垂体腺瘤细胞HP75和GH3间质转化的影响。研究结果:第一部分影响垂体腺瘤术后复发的危险因素分析单因素分析结果发现复发组年龄低于未复发组年龄(P<0.05);复发组肿瘤体积和肿瘤最大径大于未复发组(P<0.05);复发组肿瘤侵袭率高于未复发组(P<0.05);复发组肿瘤增殖率高于未复发组(P<0.05);切除程度比较,全切患者复发率最低(P<0.05)。术后残余肿瘤行伽玛刀治疗可降低复发率(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果发现肿瘤侵袭是垂体腺瘤术后复发的独立危险因素(P<0.05)。第二部分PVT1在侵袭性垂体腺瘤组织和垂体腺瘤细胞中表达的变化1.与非侵袭性垂体腺瘤组织相比,侵袭性垂体腺瘤组织中PVT1的表达显著增高。2.PVT1在GH3细胞和HP75细胞的表达水平比NHPG细胞中的表达水平显著升高。第三部分抑制PVT1抑制对垂体腺瘤细胞的增殖、成瘤、迁移的影响1.pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2载体转染效率均达80%,抑制PVT1的抑制效率60%-70%。2.抑制PVT1对垂体腺瘤细胞增殖的影响:将pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2及空白质粒转染HP75和GH3细胞。MTT法检测结果显示,pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2转染HP75和GH3细胞后,均能抑制HP75和GH3细胞生长。3.抑制PVT1对垂体腺瘤细胞克隆形成能力的影响:将pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2及空白质粒转染HP75和GH3细胞,平板克隆法检测结果显示,pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2转染HP75细胞后,均能抑制HP75和GH3细胞克隆形成能力。4.抑制PVT1对垂体腺瘤细胞侵袭迁移能力的影响:将pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2及空白质粒转染HP75和GH3细胞,Transwell侵袭实验检测结果显示,pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2转染HP75和GH3细胞后,均能抑制HP75和GH3细胞侵袭迁移能力。第四部分抑制PVT1对垂体腺瘤细胞β-连环蛋白、c-myc、细胞周期蛋白D1以及细胞间质转化标志蛋白表达水平的影响1.β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc在侵袭性、非侵袭性这两种垂体腺瘤组织的相对表达情况:和后者相比,前者的β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc的表达显著增加(p<0.05)。2.β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc在垂体腺瘤细胞HP75及正常细胞NHPG中相对表达水平:与正常细胞NHPG相比,垂体腺瘤细胞HP75中β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc这些分子的表达显著增加(p<0.05)。3.PVT1对垂体腺瘤细胞HP75和GH3中Wnt/β-连环蛋白信号通路相关分子的影响:与空白质粒对照相比,sh-PVT1质粒转染的垂体腺瘤细胞HP75和GH3中β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc这些分子的表达显著降低(p<0.05)。4.抑制PVT1表达抑制垂体腺瘤细胞HP75和GH3间质转化:与空白质粒对照相比,sh-PVT1质粒转染的垂体腺瘤细胞HP75和GH3中E-cadherin蛋白的表达显著升高(p<0.05),N-cadherin蛋白的表达显著降低(p<0.05)。结论:1.提高肿瘤全切除率是预防垂体腺瘤复发的有效方式,术后肿瘤残余及时行伽玛刀治疗有助于降低残余肿瘤的复发。肿瘤侵袭性生长是复发的独立危险因素,年轻患者需要延长术后随访期限。2.PVT1在侵袭性垂体腺瘤组织和垂体腺瘤细胞中高表达,在垂体腺瘤发生进展、侵袭转移中具有促进作用。3.pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2可成功转染HP75和GH3细胞、表达GFP荧光蛋白,成功抑制PVT1的表达。pcDNA3.1-sh-PVT1#1、pcDNA3.1-sh-PVT1#2可成功抑制下调HP75和GH3细胞内的PVT1水平。抑制PVT1的表达可降低HP75和GH3细胞生长增殖、克隆形成能力和侵袭迁移能力。4.Wnt/β-连环蛋白信号通路在侵袭性垂体腺瘤组织和垂体腺瘤细胞中可能被激活。降低PVT1水平可抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路在垂体腺瘤细胞HP75和GH3中激活。抑制PVT1的表达可通过β-连环蛋白、c-myc和细胞周期蛋白D1的表达调节垂体腺瘤细胞系HP75和GH3的增殖、迁移和上皮间质转化。