研究背景:最近的临床研究显示,超过1/3的严重创伤患者在送至急诊室之前、在创伤事故现场即可出现急性创伤性凝血病(acute traumatic coagulopathy,ATC)。ATC作为最近明确定义的早期内源性凝血功能异常,其主要临床表现包括全身血液低凝、早期纤溶亢进、纤维蛋白原浓度降低以及血小板功能障碍等。ATC由组织损伤和休克低灌注共同启动,一旦发生ATC可致输血需求增加和死亡率增高。而通过使用氨甲环酸与止血复苏等措施,早期有效治疗ATC能够明显减少输血需求和改善病人生存率。虽然目前关于ATC的研究较多,但其发病机制仍需进一步研究。研究显示蛋白C激活在ATC的发病中作为启动因素发挥重要作用,但与此同时免疫、内分泌和神经系统的功能失调与ATC的发病密切相关,并且明显影响患者预后。在严重创伤或出血性休克时,机体可迅速启动生理反应机制以维持内稳态的平衡。自主神经系统(autonomic nervous system,ANS)可通过交感神经和迷走神经的作用进行调节,进而在上述机制起到主导调控作用。在器官与系统水平交感神经与迷走神经产生的作用一般是相互对立的,因而交感/迷走神经活性之间的平衡一旦失调则表现为ANS功能障碍,并且在多种病理生理机制中发挥作用。在脓毒症、创伤或出血性休克等炎症状态下,机体早期即可出现交感过度激活和迷走活性抑制,导致明显的ANS功能障碍。心率变异性(heart rate variability,HRV)检查在创伤患者可有效反映ANS功能障碍程度,其结果与炎症反应、器官功能损害和创伤后凝血功能障碍均明显相关。目前已经明确,炎症反应与凝血功能两者之间关系密切并可互相作用;但是目前尚无研究关注在ATC中ANS功能障碍与凝血紊乱之间的关系。临床和动物研究已经证实,在炎症状态下通过抑制交感亢进和纠正迷走抑制,可有效改善ANS功能障碍,并能减轻器官功能损害和改善生存率。但纠正ATC中ANS功能障碍对减轻凝血紊乱是否有效,目前暂无相关研究。研究目的:1.评估ATC早期的ANS功能变化,明确其与ATC凝血紊乱之间的相关性。2.通过抑制交感活性/增强迷走活性,评价纠正ANS功能障碍对减轻ATC凝血紊乱的影响,并明确相关机制。研究内容如下:第一部分ATC大鼠自主神经功能障碍与凝血紊乱之间的相关性研究目的:评价ATC大鼠早期的ANS功能情况,明确其与凝血紊乱之间相关性。方法:将雄性SD大鼠以随机法分配至ATC组与Control组。通过组织损伤与出血性休克建立ATC大鼠模型。损伤休克之前与休克后0,1和2h评价HRV和血浆儿茶酚胺水平(ELISA)。休克后2h检查血栓弹力图(TEG)、PT、APTT以及促炎因子TNF-α、IL-6(ELISA)。组间数据对照采用独立样本t测验法,以Pearson相关性分析评价HRV与凝血功能之间关系。结果:休克后ATC组大鼠比Control组的PT、APTT显著增加,而儿茶酚胺水平也持续升高。TEG检查显示与Control组相比,ATC大鼠的R time和K time明显延长,而α角和MA值明显降低。HRV检查结果显示与Control组相比,ATC大鼠的总功率和高频(HF)明显降低,而低频(LF)和LF:HF比值明显升高。ATC大鼠的TNF-a和IL-6水平明显高于Control组。Pearson相关性分析显示LF以及LF:HF比值均与MA值呈明显的负相关(r=-0.89,-0.64)。结论:ATC大鼠早期即发生ANS功能障碍,表现为同时发生的交感过度激活和迷走活性抑制;同时ATC中ANS功能状态的变化与凝血异常也密切相关。第二部分抑制交感神经活性对ATC大鼠全身炎症反应和凝血异常的影响目的:通过抑制ATC大鼠交感神经活性,观察对炎症反应和凝血障碍的影响。方法:将雄性SD大鼠随机分配至Control组、ATC组、ATC+sympathectomy组(化学性交感切除)。ATC+sympathectomy组大鼠在实验前1周内接受2次腹腔注射6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,100 mg/kg),以达到sympathectomy效果。休克损伤前与之后的0,1和2h对大鼠检测HRV。在每组各时间点HRV检测完成之后,处死大鼠获取动脉血样并检测动脉血气、凝血常规检查,以及评估凝血、纤溶、炎症反应、内皮损伤和儿茶酚胺等标志物(ELISA)。结果:与Control组相比,ATC组大鼠休克后PT和APTT明显延长,儿茶酚胺水平明显上升。HRV检查显示ATC大鼠与Control大鼠相比,同时存在交感神经过度激活和迷走活性的明显抑制;而sympathectomy可同时抑制这两种变化趋势。与ATC组相比,ATC+sympathectomy组的炎症因子TNF-a和纤溶标志物t PA、PAP水平均明显降低。同时sympathectomy还有效地抑制了ATC大鼠的血浆儿茶酚胺、内皮损伤标志物syndecan-1和s TM水平;但是sympathectomy没有明显改变ATC大鼠的PT和APTT水平。结论:ATC大鼠早期即发生ANS功能障碍,并对全身炎症、多糖包被降解和凝血紊乱均有明显影响。sympathectomy可有效抑制交感活性和纠正ANS功能障碍,并可减轻炎症反应,抑制纤溶亢进和减轻内皮损伤。第三部分阻滞β-肾上腺素受体活性对ATC大鼠炎症反应和凝血障碍的影响目的:评价β-肾上腺素受体阻滞对ATC大鼠炎症反应和凝血紊乱的影响。方法:将雄性SD大鼠随机分配至Control组、ATC组、ATC+β-blocker组(β-受体阻滞剂)。ATC+β-blocker组大鼠在麻醉置管后、动物模型建立前接受腹腔注射普萘洛尔(非选择性β-受体阻滞剂,7.5 mg/kg)。休克损伤之前与之后的0,1和2h,均对大鼠评价HRV时域指标SDNN(standard deviation of normal R-R intervals)以及炎症、凝血和内皮激活等标志物(ELISA)。休克后2h评估大鼠肝组织核因子NF-κB的表达,并将大鼠肠系膜组织以镧基固定液灌注后行电镜检查显示多糖包被结构。ATC组和ATC+β-blocker组均另设一组大鼠以比较两组休克后的生存时间。结果:腹腔注射普萘洛尔明显降低了ATC大鼠心率,但是没有明显改变平均动脉压水平。HRV检查显示ATC大鼠的SDNN明显降低,反映了ATC大鼠交感神经过度激活;而普萘洛尔可有效抑制交感活性和纠正ANS功能障碍。与ATC组相比较,ATC+β-blocker组的炎症因子TNF-a、IL-6和纤溶标志物t PA、PAP水平均明显降低,同时肝脏NF-κB的活性也明显减弱。此外β-肾上腺素受体阻滞有效地抑制了ATC大鼠内皮损伤标志物s TM与syndecan-1的水平;电镜检查显示ATC大鼠的多糖包被在休克损伤后明显降解,而β-肾上腺素受体阻滞对内皮多糖包被具有保护作用。ATC和ATC+β-blocker两组大鼠在休克后的生存时间并无明显差别。结论:阻滞β-肾上腺素受体活性能够抑制ATC的交感活性亢进和纠正ANS功能障碍,并可减轻全身炎症反应、改善内皮损伤和抑制纤溶亢进;提示β-肾上腺素受体的过度激活在ATC发病中起重要作用。第四部分胆碱能抗炎途径激活对ATC大鼠炎症反应和凝血障碍的作用与机制目的:组织损伤和出血休克后高迁移率族蛋白1(high mobility group box1 protein,HMGB1)可早期大量释放入血,而HMGB1可通过模式识别受体作用引起无菌性炎症,并与创伤后凝血病密切相关。本研究中我们评价了迷走神经刺激激活胆碱能抗炎途径对ATC大鼠循环HMGB1水平与凝血紊乱的影响。方法:雄性SD大鼠被随机分配至control组、ATC组和ATC+VNS(vagus nerve stimulation,迷走神经刺激)组。ATC+VNS组在动物模型建立、休克期结束后即接受迷走神经电刺激(5V,2ms)达10分钟。休克2h后处死大鼠取得血样与组织标本。通过TEG和HRV分析ANS和凝血系统功能。通过western blotting方法评价肝脏NF-κB和HMGB1表达,通过ELISA方法检测血浆TNF-α、IL-6和HMGB1水平。取大鼠肺组织分析肺损伤程度,测量肺细胞表面syndecan-1表达,明确HMGB1和syncecan-1 m RNA水平;同时免疫组化检测糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)与HMGB1在肺组织的表达水平。结果:VNS并未明显改变ATC大鼠心率和动脉血压水平。VNS明显改善ATC大鼠的迷走活性抑制,同时有效抑制ATC大鼠K time延长和MA降低的趋势。VNS有效降低了ATC大鼠升高的血浆TNF-α、IL-6和HMGB1水平。肺组织免疫荧光染色结果显示,ATC组大鼠比control组的肺泡细胞表面的syndecan-1表达明显减弱,而VNS有效增强了肺细胞表面的syndecan-1表达。与control组相比,ATC组肺组织syndecan-1 m RNA表达减弱而HMGB1 m RNA表达增高,VNS仅明显强化了syndecan-1 m RNA的表达。ATC组大鼠肝组织的NF-κB和HMGB1的蛋白水平比control组均明显升高,而VNS仅明显抑制了NF-κB的活性。但是VNS对肝脏HMGB1蛋白水平和肺HMGB1 m RNA表达均无明显影响,说明VNS仅能抑制HMGB1的释放入血,但不改变其m RNA与蛋白水平。创伤休克导致ATC大鼠肺损伤,而VNS可有效减轻肺组织损伤。免疫组化显示ATC组肺HMGB1和RAGE表达均明显上调,而ATC+VNS组HMGB1和RAGE的表达水平明显低于ATC组。结论:VNS能够增强ATC大鼠的迷走活性、减轻ANS功能障碍,并可抑制全身炎症反应和HMGB1的早期释放入血,以及减轻内皮损伤和纠正低凝状态。上述机制可能通过NF-κB和RAGE途径发挥作用。课题总结:1.本研究结果表明ATC大鼠早期发生ANS功能障碍,表现为交感活性亢进和迷走活性抑制,并且ANS功能障碍与炎症反应和凝血紊乱密切相关。2.ATC大鼠早期交感神经活性亢进,有效抑制交感活性能够改善ATC大鼠的炎症反应、内皮损伤与凝血异常。3.阻断β肾上腺素受体活性可减轻ATC大鼠的炎症反应、内皮损伤和纤溶亢进,证实β肾上腺素受体过度激活在ATC发病中起重要作用4.ATC大鼠迷走活性明显抑制,迷走神经电刺激可改善ANS功能障碍,抑制急性炎症反应和HMGB1的早期释放入血,并减轻内皮损伤和纠正凝血功能障碍。