目的:通过替换α3→α6亚基胞外N端对应的非同源性氨基酸,构建包含α3亚基的烟碱型乙酰胆碱受体点突变型,找到α3亚基上的关键氨基酸位点,对研究α3*nAChRs与配体结合的相互作用机制,研究该受体结构与功能间的关系具有重要的作用。方法:本研究通过引物设计软件primer premier 5.0设计用于突变α3亚基的引物,并以大鼠nAChRs α3亚基的基因作为模版,通过PCR介导的定点突变技术构建α3亚基突变体。通过体外转录获得α3亚基突变体的RNA。在非洲爪蟾卵母细胞上构建受体表达模型,通过双电极电压钳技术对含有α3亚基点突变的α3β2 nAChRs表达情况进行检测。同时利用激动剂ACh对突变受体的门控特性进行检测以及用拮抗剂α-CTx RegⅡA对突变受体的功能活性进行检测。结果:本实验一共构建了 20种α3亚基突变体。激动剂ACh对野生型α3β2 nAChRs的EC50为54.82 μM,对α3(K152E)β2 nAChRs 的 EC50为 5.711 μM,与突变型 α3(K152E)β2 nAChRs 相比,野生型 α3β2 nAChRs的EC50是突变型α3(K152E)β2nAChRs的9.5倍,突变之后受体对ACh的敏感性增加。突变型α3(Y167F)β2 nAChRs、α3(S170N)β2 nAChRs不再被任何浓度的激动剂ACh所激活,表现为对激动剂ACh产生失活现象。激动剂ACh对α3亚基其他位点突变体的EC50与野生型相比,差值均在5倍以内,表现为不具有活性差异。说明α3亚基上第152、167和170位氨基酸是激动剂ACh的结合位点。拮抗剂α-CTx RegⅡA 对 α3β2 的 IC50 为 33.77 nM,对 α3(K152E)β2 的 IC50 为 233.1 nM,与野生型相比,突变型αα3(K152E)β2的IC50是野生型α3[β2的6.9倍,突变之后表现为对RegⅡA的活性下降;RegⅡA对α3(E184D)β2的IC50为0.8nM,与突变型相比,野生型α3β2的IC50是α3(E184D)β2的42倍,突变之后表现为对RegⅡA的活性增加;RegⅡA对α3(Q195T)β2 nAChRs 的 IC50 为 10.50 μM,IC50>10 μM 表现为失活状态。α-CTx RegⅡA对α3亚基其他位点突变体的IC50与野生型相比,差值均在5倍以内,表现为不具有活性差异。说明在α3亚基上第152、184、195位氨基酸是拮抗剂α-CTx RegⅡA的关键结合位点。结论:将α3亚基胞外N端非同源区段的氨基酸换成α6亚基上对应的氨基酸后,成功建立了 α3亚基一系列具有功能型的突变体。并找到了 α3亚基上影响激动剂ACh和拮抗剂α-CTx RegⅡA与α3β2 nAChRs结合的关键氨基酸位点。该模型的建立,可为研究配体与α3*nAChRs相互作用的分子机制以及区分α3*/α6*nAChR的药物设计奠定基础,也可为更多受体突变模型的建立提供方法借鉴。