【摘 要】
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弓形虫是一种专性细胞内寄生虫,可感染多种脊椎动物,如人类、鸟类、海洋哺乳动物等。弓形虫感染后,宿主通常无症状,但在一些患者中会出现颈部淋巴结肿大或眼部感染。孕妇感染弓形虫,可能会引起流产或胎儿畸形,影响胎儿的大脑、眼睛或其他器官。在免疫功能低下的患者中,弓形虫能引起肺炎、脑炎,甚至死亡。在畜牧业方面,弓形虫会导致牲畜流产和新生儿畸形,对畜牧业造成非常严重的危害。现有的治疗弓形虫病的药物副作用大、疗
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弓形虫是一种专性细胞内寄生虫,可感染多种脊椎动物,如人类、鸟类、海洋哺乳动物等。弓形虫感染后,宿主通常无症状,但在一些患者中会出现颈部淋巴结肿大或眼部感染。孕妇感染弓形虫,可能会引起流产或胎儿畸形,影响胎儿的大脑、眼睛或其他器官。在免疫功能低下的患者中,弓形虫能引起肺炎、脑炎,甚至死亡。在畜牧业方面,弓形虫会导致牲畜流产和新生儿畸形,对畜牧业造成非常严重的危害。现有的治疗弓形虫病的药物副作用大、疗效差,且对包囊内的虫体没有效果。安全有效的疫苗,可以有效的预防弓形虫病。本研究旨在构建携带弓形虫Tg GRA4（Toxoplasma gondii dense granule antigen 4）基因重组腺病毒表达载体（294-Tg GRA4）和原核表达载体（p ET30a-Tg GRA4）,体外包装重组腺病毒Ad5-Tg GRA4和体外表达Tg GRA4蛋白质,采用同源Prime-Boost（加强免疫）和异源Prime-Boost免疫策略来免疫小鼠,评价其免疫效果。首先,本研究成功构建了表达弓形虫Tg GRA4基因的重组腺病毒,在HEK293细胞内包装后进行蛋白表达。采用PCR方法扩增弓形虫Tg GRA4基因,构建重组穿梭载体p CR259-Tg GRA4;经PCR鉴定和基因测序,表明获得的Tg GRA4基因,与参考序列（M76432.1）同源性为100%。通过同源重组获得重组腺病毒载体294-Tg GRA4;经NdeⅠ酶切鉴定,表明重组腺病毒载体294-Tg GRA4构建成功。294-Tg GRA4载体经PacⅠ线性化后,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad5-Tg GRA4。通过PCR、IFA和Western Blot检测,从基因和蛋白水平上证明重组腺病毒Ad5-Tg GRA4包装成功,并能表达Tg GRA4蛋白。病毒含量测定表明初代重组腺病毒滴度为2.85×10~8TCID50/m L。其次,本研究成功构建了弓形虫Tg GRA4原核表达载体p ET30a-Tg GRA4,并表达、纯化了Tg GRA4 His-Tag融合蛋白。将Tg GRA4基因定向克隆至p ET30a（+）表达载体。经PCR鉴定和基因测序,表明获得的Tg GRA4基因,与参考序列（M76432.1）同源性为100%。通过Eco RⅠ、Xho I双酶切鉴定、SDS-PAGE电泳和Western Blot检测,表明原核表达载体p ET30a-Tg GRA4构建成功,并能表达Tg GRA4蛋白,该蛋白命名为p Tg GRA4。制备的重组腺病毒和重组蛋白,分别以同源Prime-Boost（p Tg GRA4单独组和Ad5-Tg GRA4单独组）和异源Prime-Boost（Ad5-Tg GRA4/p Tg GRA4）免疫BALB/c小鼠。用ELISA方法检测免疫小鼠血清中特异性抗体水平以及细胞因子浓度。结果表明,Ad5-Tg GRA4/p Tg GRA4组Ig G、Ig G1、Ig2a抗体水平显著高于Ad5-Tg GRA4组和p Tg GRA4组;Ad5-Tg GRA4/p Tg GRA4组IFN-γ水平显著高于p Tg GRA4组,但与Ad5-Tg GRA4组差异不显著;Ad5-Tg GRA4/p Tg GRA4组IL-4水平显著高于Ad5-Tg GRA4组和p Tg GRA4组。Ad5-Tg GRA4/p Tg GRA4组,诱导了强大的细胞免疫和体液免疫。进行弓形虫的PLK-GFP株攻虫实验,Ad5-Tg GRA4/p Tg GRA4组明显提高了小鼠的存活率。虽然,3组均不能完全抑制小鼠脑内包囊的形成,但Ad5-Tg GRA4/p Tg GRA4组有显著减轻脑组织荷虫量的趋势。结论,本试验采用的异源Prime-Boost的免疫策略,以重组腺病毒作为基础免疫,重组蛋白进行强化免疫,在弓形虫病的预防中显示出良好的效果。
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