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增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在分裂旺盛的细胞内具有很强的活跃性,主要参与细胞周期调控、DNA的复制、DNA损伤修复及表观遗传修饰。经差异蛋白质组学研究发现,PCNA的含量与柱头发育成负相关,在柱头发育的早期表达量较高,随柱头的发育表达量下降。本试验利用以CytoTrap细胞质酵母双杂交系统筛选PCNA相互作用蛋白、5’RACE克隆、并利用实时荧光定量PCR方法分析基因的表达等。获得主要结果如下:(1)分别以羽衣甘蓝的PCNA1和PCNA2基因为模板,构建酵母pSos-PCNA1和pSos-PCNA2诱饵表达载体,进行酵母双杂交自激活检测。结果发现PCNA1和PCNA2不存在自激活现象,可以进行蛋白质相互作用的筛选。(2)以CytoTrap细胞质酵母双杂交系统检测PCNA1与PCNA2之间的相互作用,结果显示,PCNA1与PCNA2不仅与自身发生相互作用在它们之间也存在相互作用。(3)以pSos-PCNA1和pSos-PCNA2为诱饵载体,利用CytoTrap细胞质酵母双杂交系统,通过共转化的方法对羽衣甘蓝柱头酵母cDNA文库进行筛选,获得了两个与PCNA2相互作用的蛋白。一个是胚胎干细胞特异性5-羟甲基胞嘧啶结合蛋白(embryonic stem cell-specific 5-hydroxymethylcytosine-binding protein,ESCHBP1),另一个是蛋白质磷酸酶 2C21(probable protein phosphatase 2C21,PP2C21)。ESCHBP1全长 cDNA 序列为1507 bp,包含5’非翻译区185 bp、3’翻译区145 bp和一个长度为1177 bp的开放阅读框,对应编码391个氨基酸残基的蛋白质,与油菜ESCHBP1序列有97%的一致性。PP2C21全长cDNA序列为1366 bp,包含5’非编码区69 bp、3’非编码区223 bp和一个长度为1074 bp的开放阅读框,对应编码357个氨基酸残基的蛋白质,与油菜PP2C21序列有99%的一致性。(4)通过实时荧光定量PCR,确定羽衣甘蓝不同材料和柱头发育时期的最佳内参基因分别是Tub-α6和Actin。利用内参基因分析PCNA的表达情况,发现在不同组织中,PCN41在子房中表达量最高,在不同发育时期的柱头中,PCNA1的表达含量均随着柱头的不断成熟而下降,在柱头接近成熟时表达含量趋于稳定,PCNA2的表达含量与PCNA1相似。ESCHBP1在羽衣甘蓝花瓣中表达量最高,在柱头的不同发育时期,ESCHBP1随柱头成熟表达含量先降低后升高。PP2C21在柱头中表达含量最高,在柱头的不同发育时期随柱头的成熟而不断升高,在花蕾为8～10mm时的柱头中达到最高。(5)以羽衣甘蓝ESCHBP1和PP2C21基因为模板,构建pMyr-ESC和pMyr-PP2酵母表达载体。然而在CytoTrap细胞质酵母双杂交系统中并没有检测出ESCHBP1和PP2C21的全长与PCNA1/PCNA2相互作用。