[目的]本研究对大承气汤配伍后化学成分变化、药效、药动、物质基础以及剂量配伍进行研究。课题在全方不同煎法组合、药对不同煎法组合、大黄单味药不同煎法等多个层次上,同时测定多个指标性成分的含量,对大承气汤复方配伍的化学物质基础进行阐明,并追踪药理作用,研究指标性成分的药代动力学特性,层层推进,互相印证,研究大承气汤复方物质基础及其与药理作用的相关性,阐明其配伍的科学内涵及其在体内的动态过程,为临床应用和制剂的开发提供科学依据。[方法]一、大承气汤复方配伍成分变化研究针对中药化学成分的复杂性,对色谱流动相、比例,检测波长,色谱柱温度,进样量等色谱条件进行优化,建立并应用全方HPLC、UPLC-MS统一分析方法,测定大承气汤及组方单味药中化学成分含量。二、大承气汤“除身热”药效学实验1大承气汤对ABP小鼠泻下作用的影响灌胃给予ABP小鼠大承气汤后,采用ABP小鼠小肠墨汁推进率,观察排便时间、24h内饮水量、24h内排便量为指标,研究大承气汤对ABP小鼠的泻下作用。2大承气汤对ABP小鼠血浆内毒素的作用灌胃给予ABP小鼠大承气汤后,应用鲎试剂盒检测ABP小鼠外周血及回肠内容物中ET含量,研究大承气汤对ABP小鼠内毒素的影响。3大承气汤对ABP小鼠血浆NO和TNF-α的干预灌胃给予ABP小鼠大承气汤后,应用NO和TNF-α试剂盒检测ABP小鼠血浆NO和TNF-α水平,研究大承气汤对ABP小鼠血浆NO和TNF-α的影响。三、大承气汤水煎液大鼠体内药动学研究1大承气汤中蒽醌类成分药动学研究建立并应用蒽醌类成分大鼠血浆样品处理方法及HPLC条件,检测大承气汤水煎液中蒽醌成分的入血量,应用药动学软件DAS2.1.1计算各成分的药动学参数[包含T1/2(Ka)(h)、T1/2(Ke)(h)、Cmax (mg/L)、Tmax (h)、AUC0-t(mg/L·h)]。2大承气汤中厚朴酚类成分药动学研究建立并应用厚朴酚类成分大鼠血浆样品处理方法及UPLC-MS条件,检测大承气汤水煎液中厚朴酚类成分入血量,应用药动学软件DAS2.1.1计算各成分的药动学参数。3大承气汤中黄酮类成分药动学研究建立并应用黄酮成分大鼠血浆样品处理方法及HPLC条件,检测大承气汤水煎液中该成分的入血量,应用药动学软件3P97分别计算出柚皮素、橙皮素的药动学参数。4大承气汤指标成分代谢研究应用全方HPLC、UPLC-MS分析方法,检测大鼠代谢物中游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚、柚皮素、橙皮素、柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷的含量。四、量效关系研究应用皮尔逊相关分析和灰关联分析对大承气汤配伍后成分变化与药效进行相关分析。[结果]一、大承气汤复方配伍成分变化研究1大承气汤配伍水提液化学成分变化全方配伍后柚皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积没有变化,而橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚的峰面积都增加。2全方与单味药不同极性提取部位的成分变化单味药与全方相比较,在煎煮过程中,有很多单味药所含成分,在全方中检测不到或者含量减低；总体而言,在较大极性提取溶剂中,大黄(芦荟大黄素、大黄酸)和枳实(橙皮苷)所含成分在全方中呈增大,在极性较低的提取溶剂中呈现含量降低,或检测不到；而厚朴则刚好相反。3单味药与全方UPLC-MS研究由大黄、厚朴、枳实和大承气汤的总离子图谱及结合m/z图谱可知：①大黄药材提取液中没有检测到大黄素甲醚,大承气汤水煎液中并未找到大黄水煎液中保留时间为18.97min的成分。②厚朴药材提取液中,厚朴酚在大承气汤检测中,显示为减弱。③枳实、大承气汤和标准品相对比,枳实和大承气汤中检测到橙皮苷和柚皮苷成分,且含量增加,以橙皮苷含量增加幅度较大；大承气汤中并未找到在枳实水煎液中所检测到的保留时间为28.83min和34.04min的成分,并且在枳实水煎液中保留时间为41.38min的成分,在全方中明显减弱。④经综合对比全方水煎液、大黄水煎液、厚朴水煎液和枳实水煎液的UPLC-ESI-MS图谱,全方水煎液中保留时间为24.74min和40.15min的成分为四种单味药配伍而出现的,因分离和检测条件的限制,现阶段并未对大承气汤中保留时间为24.74min和40.15min的成分作出结构的鉴定。二、大承气汤“除身热”药效学实验1大承气汤对ABP小鼠泻下作用的影响观察大承气汤对ABP小鼠的泻下作用；得出大承气汤各实验组均可促进ABP小鼠快速排便,也可使ABP小鼠大便软化,从而ABP小鼠体内燥屎得以迅速排出体外。2大承气汤对ABP小鼠血浆内毒素的作用灌胃给予ABP小鼠大承气汤后,得出大承气汤不同剂量组均对ABP小鼠外周血、回肠内容物中的内毒素中内毒素含量有较大的清除作用,可有效减少ABP小鼠外周血和回肠内容物中内毒素的含量,但阳性组则无此作用。3大承气汤对ABP小鼠血浆NO和TNF-α的干预灌胃给予ABP小鼠大承气汤后,得出经典大承气汤不同剂量组均对ABP小鼠血浆NO含量有较大的干预作用,其作用效果是随着用药剂量的增加,ABP小鼠血浆中NO的含量增加、血浆TNF-α含量减少。Doehlert设计组成的大承气汤总体作用效果不及DCQ-1组。三、大承气汤水煎液大鼠体内药动学研究1大承气汤中蒽醌类成分药动学研究经对大鼠含药血浆的检测可知,大承气汤君药大黄中所含的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚均可在血浆中检测到,应用药动学软件DAS2.1.1分别计算出血浆中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的T1/2(Ka)(h)依次是0.362、1.034、1.918、1.89、0.656；T1/2(Ke)(h)依次是0.311、1.173、2.330、2.188、0.810; Cmax (mg/L)依次是48.47、21.69、10.49、5.76、38.76；Tmax(h)依次是4、4、6、4、2；AUC0-1(mg/L·h)依次是85.733、66.726、65.911、41.840、96.401。2大承气汤中厚朴酚类成分药动学研究经对大鼠含药血浆的检测的血浆中并未检测到和厚朴酚、厚朴酚成分。3大承气汤中黄酮类成分药动学研究大承气汤枳实中所含的柚皮素和橙皮素均可在血浆中检测到,应用药动学软件3P97分别计算出柚皮素、橙皮素的药动学参数：T1-2(Ka)(h)依次是2.106、2.142；T1/2(Ke)(h)依次是5.842、5.491；Cmax(mg/L)依次是3.492、2.574；Tmax (h)依次是；AUC0-1(mg/L·h)依次是39.407、34.886。4大承气汤指标成分的代谢研究游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚从尿液途径排除体外的量所占比例甚小(约为总量的10%),游离蒽醌从粪便途径排除体外的量所占比例很大(约为总量的90%)。在对灌胃给药大鼠24h尿液、粪便分析中显示,既能检测到柚皮素、橙皮素,又能同时检测到柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷。四、大承气汤成分变化与药效相关分析1 PEARSON量效关系研究研究相关分析表明：其药效指标Y1、Y2、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8 (ABP小鼠小肠墨汁推进数据记为Y1,将ABP小鼠排便时间记为Y2,将ABP小鼠24h内排便量记为Y4,将ABP小鼠外周血中ET含量记为Y5,将ABP小鼠回肠内容物中ET含量记为Y6,将ABP小鼠血浆中NO含量记为Y7,将ABP小鼠血浆中TNF-α含量记为Y8)均随着计量的增大药效也增大,且与模型组差异具有显著性意义(P<0.05)。与Y3(ABP小鼠24h内饮水量)差异没有显著性意义(P>0.05)。2 GRA谱效关系研究GRA分析显示,其关联序大于0.85的主要为3、4、6、8、10、14、17、18、38、50号峰,其中包括了黄酮成分；关联度在0.85-0.80之间,包含蒽醌成分与厚朴酚成分。[结论]一、大承气汤复方配伍成分变化研究1检测方法的建立建立了全方HPLC、UPLC-MS统一分析方法,并对分析方法做了仪器精密度、样品稳定性和方法重复性等考察,表明此两种方法稳定、可靠、重现性好。2单味药与全方不同极性提取部位的成分变化大承气汤较单味药来看,其极性成分在全方中溶出率普遍增大,而且以大黄(芦荟大黄素、大黄酸)和枳实(橙皮苷)成分增大为主,得配伍后,所产生的综合药效与大黄和枳实极性成分的溶出,厚朴的较低极性成分的溶出有极大关系。3单味药与全方UPLC-MS研究经综合对比全方水煎液、大黄水煎液、厚朴水煎液和枳实水煎液的LC-ESI-MS图谱,全方水煎液中保留时间为24.74min和40.15min的成分为四种单味药配伍而出现的,因分离和检测条件的限制,现阶段并未对大承气汤中保留时间为24.74min和40.15min的成分作出结构的鉴定。这些含量发生变化的色谱峰所对应的成分,可能就是大承气汤配伍作用的化学物质基础。二、大承气汤“除身热”药效学实验1大承气汤对ABP小鼠泻下作用的影响大承气汤各实验组均可促进ABP小鼠快速排便,也可使ABP小鼠大便软化,从而ABP小鼠体内燥屎得意迅速排出体外,避免的粪固醇类物质在体内产生更多的热量,这是大承气汤对于其“除身热”功效起到“釜底抽薪”的作用。2大承气汤对ABP小鼠血浆内毒素的作用大承气汤可降低血浆内毒素水平；减少内毒素含量的同时也减少了内毒素对热量的释放以及内毒素产热的几率,从而减少体内热量的产生。3大承气汤对ABP小鼠血浆NO和TNF-α的干预大承气汤治疗的ABP小鼠,血中NO增加、TNF-α显著降低。结合文献可把降低炎症介质的可能机制归纳为：①有增强胃肠道运动功能,增加肠血流量,降低肠粘膜通透性；②下调巨噬细胞活性,降低TNF-α等炎症细胞因子的产生和释放；③对抗氧自由基,防止过氧化损伤；等。三、大承气汤水煎液大鼠体内药动学研究1大承气汤中蒽醌类成分药动学研究本实验建立了大承气汤水煎液给药后蒽醌类成分大鼠血浆HPLC检测条件及血浆样品处理方法方法。能够较准确地检测大承气汤水煎液中蒽醌成分的入血量。经对大鼠含药血浆的检测可知,君药大黄中所含的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚均可在血浆中检测到,应用药动学软件DAS2.1.1分别计算出血浆中该五种成分的药动学参数,得出五种游离蒽醌成分均体现为一室模型。2大承气汤中厚朴酚类成分药动学研究经对大鼠含药血浆的检测的血浆中并未检测到和厚朴酚、厚朴酚成分,表明在含药血浆中不含厚朴酚类成分,可能原因为厚朴酚类成分不入血或者是入血与血红蛋白结合形式存在。3大承气汤中黄酮类成分药动学研究本实验建立了大承气汤水煎液给药后黄酮类成分大鼠血浆HPLC检测条件及血浆样品处理方法,方法稳定可控,重现性好,能够较准确地检测大承气汤水煎液中黄酮成分的入血量。经对大鼠含药血浆的检测、动态分析,应用药动学软件3P97分别计算出柚皮素、橙皮素的药动学参数,结果显示,此两种成分均体现为一室模型。4大承气汤指标成分代谢研究游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚主要以粪便途径排除体外。在对灌胃给药大鼠24h尿液、粪便分析中显示,既能检测到柚皮素、橙皮素,又能同时检测到柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷；总体来说,苷元形式排除体外的量所占比例大于苷类。四、大承气汤成分变化与药效相关分析选取芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚等作为部分质控、工艺优化指标和药效的物质基础具有一定的科学性。本研究在中医药学理论和实践的指导下将中药学、分析化学、药理学、统计学和计算机技术相结合,进一步明确大承气汤的物质基础探讨了其复方的配伍机制、药效物质基础,为大承气汤方药配伍及中药复方配伍的方法学研究提供了理论依据。