脑胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤，起源于神经上皮。在我国，其发病率约占颅脑肿瘤的44%左右。同人体其它各个系统的肿瘤一样，严重威胁着人民的健康与生命。胶质瘤有多种发病原因，其最根本原因可能是抑癌基因失活和癌基因被激活以及相关分子信号通路的改变。手术切除、放射外科、化学药物等传统治疗方法，效果仍难以令人满意。除了传统的治疗方法外，尚包括基因靶向治疗、免疫治疗以及联合治疗等多种生物治疗方法，并且成为目前胶质瘤治疗研究的热点。近年来，国内外一些学者发现蝎毒素具有肿瘤抑制作用，并不断深入研究，发现蝎毒素中的某些成分对胶质瘤细胞具有靶向作用，可作用于胶质瘤细胞膜上不同类型的离子通道，从而产生一定的肿瘤抑制作用。目前，国内学者研究最多的氯离子通道蝎毒素是从东亚钳蝎(Buhtus maretnsii Karhsch，BmK)粗毒中提取的BmK CT，可特异性靶向作用于神经胶质瘤细胞，抑制细胞的生长、侵袭与转移。国内山西大学分子生物研究所付月君等学者依据BmKCT cDNA序列，进行优化重组，得到东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素基因（recombinant BmK CT artiafet，rBmK CTa)，并申请了专利。本项研究是在山西大学分子生物研究所的大力指导、帮助下，利用已提取的东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa，用腺病毒对其进行包装。经体外实验，初步研究该基因对U251脑胶质瘤细胞的抑制作用。同时联合细胞毒性化疗药物替莫唑胺（TMZ）共同作用于该胶质瘤细胞，探讨相关肿瘤抑制作用。本课题首先构建腺病毒介导的东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素，即Ad-rBmKCTa。应用AdEasy-1System腺病毒载体系统，将rBmK CTa基因克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV，从而得到重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-rBmK CTa。随后，经酶切等作用，与腺病毒的pAdEasy-1骨架质粒共转化BJ5183菌进行同源重组，构建出重组的腺病毒质粒pAd-rBmK CTa。再经PacI酶切、线性化后的重组质粒转染293A细胞，成功构建出Ad-rBmK CTa。经PCR初步鉴定，确定为Ad-rBmK CTa后，再反复感染293A细胞进行大量扩增。继而采用氯化铯梯度离心法提纯、浓缩该病毒。最后，经测定该病毒效价达3.5x1012pfu／ml。其次，本课题体外分别将Ad-rBmK CTa、TMZ以及二者联合作用于U251细胞，通过MTT实验观察各自对该细胞的抑制作用。结果显示随着Ad-rBmK CTa效价、TMZ浓度升高以及作用时间延长等，对U251细胞的抑制增强，最高抑制率分别达82.81%、83.2%和94.27%。FCM检测细胞凋亡，发现Ad-rBmK CTa和TMZ单独作用时，促细胞凋亡作用并不明显。而二者联合作用时，促凋亡作用明显增强，细胞凋亡率可达32%。同时，联合作用U251细胞，其细胞周期阻滞时相提前，约62.5%细胞停滞于G0G1期。通过Western blot实验比较相关凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Bcl-2表达水平，进一步证实二者联合产生的促凋亡作用大于单一作用。同时，因Bcl-2蛋白是细胞的两种程序性死亡凋亡和自噬的联系纽带，所以考虑对U251细胞的抑制作用尚存在促进自噬作用。目前研究已证实TMZ促进胶质瘤细胞自噬是其肿瘤抑制的主要机制之一。我们认为二者联合作用产生细胞抑制的机理可能为：二者产生协同效应，大大增加了促凋亡作用；Ad-rBmK CTa通过抑制MMP-2活性，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，并促使细胞阻滞于细胞周期时相的早期，增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，自噬作用增强。综上所述,腺病毒介导的rBmK CTa基因可以抑制U251胶质瘤细胞增殖；Ad-rBmK CTa和TMZ联合靶向作用产生协同效应，对肿瘤细胞的抑制作用显著增强。但协同作用机制尚不完全明了，我们将继续深入研究，进一步阐明Ad-rBmK CTa联合TMZ作用机理。同时，下一步将进行小鼠活体研究，为腺病毒介导的rBmK CTa基因靶向治疗以及联合化疗提供更有力的理论依据。随着国内外相关研究的不断发展，rBmK CTa极可能发展成为新的细胞毒素类药物，为治疗脑胶质瘤提供新的希望。