1.1研究背景和目的:椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）是下腰痛的常见原因。一般表现为基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）和促炎细胞因子表达上调,功能性髓核细胞（nucleus pulpossus cells,NPCs）数量减少,解剖形态学改变。IVDD发生的机制包括软骨终板（cartilage endplate,CEP）为纤维环内层细胞和NPCs提供营养减少及CEP调控IVD合成代谢减弱和分解代谢增强,进而导致NPCs凋亡和IVDD发生,因此,软骨终板在调控椎间盘退变中的作用及相关机制研究为我们治疗椎间盘退变提供重要方向。CEP是位于椎间盘上下两侧的透明软骨。在既往的临床统计分析中,我们发现在合并软骨终板炎的腰椎间盘退变患者中,腰椎摘除术后,其腰痛的复发率明显高于未合并软骨终板炎的腰椎间盘退变患者,这可能提示CEP在IVDD进程中起到重要作用,但是具体的机制仍不明确。研究表明,在人和小鼠的CEP组织中,存在着可以向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的祖细胞,这些祖细胞被定义为软骨终板干细胞（cartilage endplate stem cells,CESCs）,它们在维持CEPs的结构完整和正常功能方面有着非常重要作用。髓核（Nucleus pulposus,NP）和纤维环（Annulus fibrosus,AF）是IVD的主要结构成分。NPCs分泌细胞外基质成分有助于维持IVD的生物力学功能,功能性NPCs的减少会导致IVDD,因此,再生NPCs可能是治疗IVDD的一个潜在策略。虽然研究表明CESCs可以通过向髓核细胞样转化促进NPCs再生和调节IVD稳态,然而,我们并不知道CESC-Exos是否能通过自分泌方式调控CESCs向髓核内迁移及转化为NPCs。Gata结合蛋白4（GATA4）是一种结合DNA的锌指转录因子,已被证明可以调节多种生物学过程,包括增殖、分化和血管生成。在骨形成和发育过程中,GATA4通过调节Runt相关转录因子2（Runx2）、骨形态发生蛋白（BMP）、转化生长因子（TGF-β）等关键蛋白,在促进成骨分化方面发挥重要作用。然而,迄今为止,还没有人研究CESCs-Exos是否可以调控CESCs表达GATA4,及评估GATA4在促进CESCs在向NPCs迁移和分化中起到的作用。外泌体（exosomes,Exos）是直径为30～150nm的细胞外囊泡。外泌体存在于各种体液中,包括血浆、精液、唾液、尿液、羊水、滑膜液和母乳等。外泌体可以运输蛋白、小RNA进入细胞内环境,在增殖、分化、自噬和其他细胞活性相关的信号转导方面发挥着重要作用。在肝脏缺血再灌注损伤的病理改变中,外泌体可以促进正常肝脏细胞增殖,修复受损肝脏;值得注意的是,间充质干细胞衍生的外泌体注入IVD后可通过激活自噬相关信号通路抑制NPCs凋亡,改善IVDD。自噬是一种必要的细胞内分解代谢过程,在炎症、营养缺乏和应激条件下,通过降解受损细胞器和有毒蛋白来控制细胞代谢并维持细胞生存。自噬可以降解凋亡蛋白来调节各种疾病的进展,如癌症、神经退行性疾病和骨关节炎。此外,来自MSCs的外泌体可以通过激活PI3K/AKT/自噬信号通路抑制细胞凋亡。CESC-Exos是否可以通过活化髓核细胞内自噬通路来抑制NPCs凋亡和IVDD发生并没有人进行报道。鉴于此,本课题通过对软骨终板干细胞来源的外泌体（CESCs-Exos）在促进CESCs转分化为NPCs及抑制NPCs凋亡进行研究,分析了CESCs自分泌外泌体是否可以通过激活缺氧诱导因子（HIF）-1α/Wnt通路和增加GATA4/TGF-β表达,促进CESC迁移和转分化为NPCs;并对CESCs-Exos抑制NPCs凋亡机制进行研究,探讨CESCs及其分泌的外泌体在抑制IVDD中作用和意义。1.2方法:1.2.1软骨终板干细胞来源的外泌体激活Akt/自噬来抑制髓核细胞凋亡和IVDD1.2.1.1验证软骨终板可调控椎间盘退变1)收集病人临床数据,分析合并的软骨终板炎的IVDD患者和未合并软骨终板炎的IVDD患者腰痛复发率。2)动物模型验证TBHP可以诱导软骨终板炎,并且软骨终板炎后加重椎间盘退变进展。3)提取鉴定CESCs及其分泌的外泌体,并验证TBHP可以诱导CESCs退变。4)提取正常CESCs和退变的CESCs产生的外泌体,并进行质谱分析、KEGG和GO数据分析。1.2.1.2体外细胞功能实验及机制探讨1)提取、鉴定NPCs细胞。2)免疫荧光、WB及流式细胞学分析正常或退变的CESCs产生的外泌体对NPCs凋亡抑制效果的差异。3)正常的CESCs分泌的外泌体（N-Exos）与TBHP体外诱导CESCs退变后而获得的外泌体（D-Exos）处理髓核细胞后,免疫荧光、电镜和WB检测分析自噬小体和自噬蛋白在髓核细胞中的表达。4)正常或退变的外泌体处理髓核细胞后,WB分析NPCs中AKT增殖通路激活情况。5)抑制AKT通路后,WB、免疫荧光和流式细胞学分析NPCs凋亡变化。1.2.1.3体内实验研究1)构建大鼠椎间盘退变模型,并用正常外泌体或AKT通路抑制剂LY294002进行处理。2)磁共振成像和免疫荧光染色验证LY294002加重IVDD,而正常外泌体抑制IVDD。1.2.2自分泌外泌体促进软骨终板干细胞转分化为髓核细胞,从而抑制IVDD1.2.2.1划痕实验、Transwell实验、WB、免疫荧光和q RT-PCR验证CESCs自分泌的外泌体在调控CESCs侵袭、转移和分化上的作用1.2.2.2体外细胞学实验,如划痕实验、Transwell实验、WB、免疫荧光和μl q RT-PCR,分析缺氧诱导因子（HIF）-1α/Wnt通路在促进GATA4/TGF-β表达,进而调控CESCs的转移和分化上的作用。1.2.2.3磁共振成像和免疫组化的方法分析过表达或未过表达GATA4的CESCs在修复IVDD中的效果1.3结果1.3.1炎症和退变的CEP加速人和大鼠IVDD进展患者的临床数据表明,合并软骨终板炎的腰椎间盘突出症患者的腰痛复发率为11.66%,没有合并软骨终板炎的腰椎间盘突出症患者的腰痛复发率为2.5%.我们利用TBHP构建了软骨终板炎和/或腰椎间盘退变的动物模型。结果显示,TBHP诱发CEP炎症和退变,而且退变的软骨终板加速IVDD进展1.3.2软骨终板干细胞来源的外泌体激活Akt/自噬来抑制髓核细胞凋亡和IVDD进展1.3.2.1提取CEP内细胞鉴定发现其具有干细胞特性,并且可以分泌外泌体;而且,TBHP可以诱导正常的CESCs进入退变状态。从大鼠CEP组织中分离出CESCs,并进行成骨、成软骨分化和成脂肪分化。流式细胞术结果显示,大多数CESCs阳性表达干细胞表面标记物CD90和CD44,少量细胞表达细胞表面标记物CD45。使用TEM、NTA和WB分析外泌体的形态、大小和标记蛋白来鉴定CESCs分泌的外泌体。结果表明,大鼠CESCs具有干细胞特性并且可以分泌外泌体,采用不同浓度的TBHP或不同的诱导时间处理CESCs。RT-q PCR和WB结果显示,随着TBHP浓度和时间的增加,IL-6、TNF-α、IL-1β和MMP13的基因表达水平显著升高。1.3.2.2与D-Exos相比,N-Exos具有活化自噬功能,而且具备更有效抑制NPCs凋亡的作用。对获得的N-Exos和D-Exos进行质谱和Heat Map分析,发现N-Exos和D-Exos携带的蛋白有明显的差异。对N-Exos和D-Exos中所含蛋白进行KEGG富集分析、GO数据分析及WB、免疫荧光和流式细胞学,结果表明与D-Exos相比,N-Exos可更有效的激活自噬及抑制凋亡1.3.2.3 N-Exos通过激活PI3K/AKT/自噬信号通路抑制髓核细胞（NPCs）凋亡我们用N-Exos和D-Exos来处理NPCs,发现N-Exos处理后,NPCs内的p-AKT信号通路被明显激活。我们检查了其他的信号通路,如p-ERK1/2和p-JNK,但未发现显著变化。N-Exos处理NPCs后,细胞胞凋亡率和凋亡蛋白显著降低,自噬蛋白比率LC3B/A和p-AKT水平升高。加入AKT抑制剂LY294002（20μmo L/m L）处理3天,p-AKT通路和自噬通路被抑制,NPCs凋亡增加,说明N-Exos通过激活PI3K/AKT/自噬信号通路来抑制NPCs凋亡。1.3.2.3 N-Exos通过激活PI3K/AKT/自噬通路减轻大鼠椎间盘退变为了确认外泌体可以注射到IVD中,我们用DIR标记外泌体并进行了动物活体成像。我们发现,与未标记的外泌体相比,6小时后,DIR标记的N-Exos（DIR-N-Exos）在IVD中有信号。为了进一步证实N-Exos通过激活AKT/自噬通路抑制NPCs凋亡,改善IVDD,我们将大鼠分5组:NC组、针刺组、针刺+LY294002（20μmol）组、针刺+N-Exos（40μg）组、针刺+N-Exos（40μg）+LY204002（20μmol）组。6周后对治疗部位进行MRI检查。结果表明,与对照组相比,穿刺加重了椎间盘退变。PI3K/AKT抑制剂LY294002加剧了IVDD的进展,外泌体减轻了椎间盘退变,但LY294002减弱了外泌体介导的对IVDD进展的抑制效果。在手术处理3周后,从治疗部位提取NP组织进行WB实验。结果显示,与对照组相比,穿刺+LY294002组的LC3B/A比值和p-AKT水平显著降低,而穿刺+外泌体组的LC3B/A比值和p-AKT水平显著升高。抑制剂LY294002抑制外泌体介导的NPCs自噬促进和p-AKT通路的激活。免疫荧光染色结果表明,外泌体抑制cleaved caspase3的表达,激活p-AKT/自噬通路,但LY294002减弱了N-Exos的这些作用。1.3.3 CESCs通过自分泌的外泌体促进CESCs转分化为髓核细胞及抑制IVDD1.3.3.1 CESCs分泌的外泌体促进CESCs向NPCs转分化将CESC-Exos（20或40μg/m L）在37℃下处理CESCs 24小时。处理后的CESCs表现出更强的迁移和侵袭能力。q RT-PCR结果显示,外泌体处理CESCs后,与细胞迁移相关的趋化因子激活水平显著升高。而且免疫荧光显示,外泌体处理CESCs后,CESCs中Collagen II（NPCs标志物蛋白）水平升高。然后用western blotting检测CESCs中表达Collagen II、SOX9、Collagen I和Acan水平。结果发现,处理组CESCs中髓核细胞标志物Collagen II和SOX9的表达增加。1.3.3.2 CESC-Exos通过激活HIF-1α促进了CESC的侵袭、迁移和分化经0、20、40ug/ml外泌体处理的CESCs中HIF-1α表达增加。用慢病毒过表达HIF-1α来检测HIF-1α在CESCs中的作用。与NC组相比,Lenti-HIF-1α组及Exo（40μg/m L）组的CESCs的迁移和侵袭能力均有提高,而HIF-1α组与CESCs-Exos（40μg/m L）共处理的CESCs迁移和侵袭能力提高的更为明显。免疫荧光分析显示,HIF-1α组与CESCs-Exos（40μg/m L）共处理的CESCs中I型胶原表达减少,而II型胶原蛋白、ADAMTS5和SOX9的蛋白表达水平升高。这些结果表明,CESC-Exos通过激活HIF-1α信号通路促进了CESC的分化。1.3.3.3.HIF-1α通过激活Wnt/GATA4/TGF-β通路促进CESCs向NPCs分化KEGG富集分析显示Wnt信号通路在CEP退变分化过程中被明显激活。western blotting结果显示,Gata4在Lenti-HIF-1α组表达增加,而在Lenti-HIF-1α+MSAB（Wnt通路抑制剂）组表达降低。WB和免疫荧光分析发现当不同浓度的Wnt激动剂1（0、10、20 m M）处理CESCs过程中,随着处理浓度增加,β-catenin、TCF-4、SOX9和GATA4的蛋白表达水平逐渐升高。这些结果表明,增加HIF-1α表达可增强Wnt信号通路的激活,从而刺激GATA4表达,促进CESC分化。过表达GATA4慢病毒感染CESCs,通过q RT-PCR和western blotting检测发现,Lenti-Gata4组中TGF-β1升高最为明显,而且EGF表达水平升高,集落刺激因子-1（CSF-1）、血小板衍生生长因子（PDGF）表达水平降低。在lenti-Gata4处理组中,SOX9、collagen II、TGF-β1蛋白表达升高,而在TGF-β抑制剂PFD共处理后,SOX9、collagen II、TGF-β1蛋白表达降低,提示GATA4促进CESs C向NPCs分化的作用被TGF-β抑制剂阻断。免疫荧光分析结果也表明TGF-β抑制剂阻断了GATA4促进CESC向NPCs分化的作用,而TGF-β1激动剂SRI-011381提高了CESCs的侵袭、迁移和向NPCs分化的能力。基于以上结果,GATA4可以通过TGF-β1信号通路促进了CESC的侵袭、迁移和分化。1.4结论:1.4.1软骨终板炎加重IVDD患者腰椎摘除术后腰痛的复发率1.4.2 CEP中存在CESCs,与退变的CESCs来源的外泌体相比,正常的CESCs来源的外泌体可以更有效的通过激活PI3K/AKT信号通路促进自噬抑制NPCs细胞凋亡和椎间盘退变,这些结果为外泌体作为预防和治疗IVDD的工具提供了进一步的支持。1.4.3 CESCs自分泌的外泌体可激活CESCs中HIF-1α/Wnt信号通路,增加GATA4和TGF-β1的表达,从而促进CESCs向IVD迁移和向NPCs转化,抑制IVDD,为IVDD治疗提供了一种新作用靶点和方式。综上所述,CESCs在改善IVDD的进程中有着重要的作用,一方面可以通过释放外泌进入NPCs,活化NPCs自噬及抑制其凋亡,另一方面可以通过自分泌外泌体调控、活化CESCs内HIF-1α/Wnt信号通路,增加GATA4和TGF-β1的表达,从而促进CESCs向IVD迁移,并向NPCs转化,抑制IVDD。