目的构建靶向Cbl-b基因的短发夹环RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并转染至MGC803胃癌细胞中,用G418进行筛选,建立Cbl-b shRNA稳定转染的MGC803细胞株,并进行检测。利用这种稳定转染的胃癌MGC803细胞系,进行Cbl-b调节EGFR信号转导通路的相关研究。方法1、引物设计根据Cbl-b基因序列,通过软件设计三个靶序列,利用BLAST进行同源性分析,设计出2组Cbl-b shRNA序列及1组对照靶序列。shRNA排列顺序均为：BamHⅠ酶切位点+反义序列+loop+正义序列+TC+HindⅢ和BamHⅠ酶切位点+正义序列+loop+反义序列+AG+HindⅢ。2、构建Cbl-b ShRNA质粒选用pRNA-U6.1/Neo (Genscript, Piscatcway)作为载体。化学合成法合成shRNA序列,将配对的单链合成双链,采用Bam-HI/HindⅢ限制性内切酶进行酶切后,以T4连接酶连接于同样经过采用Bam-HI/HindⅢ限制性内切酶进行酶切后的pRNA-U6.1/Neo载体内。将构建成的表达质粒转化至感受态菌DH5α中,将菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB平板,筛选阳性菌落。3、测序对构建完毕的质粒进行测序,通过检测结果可以看出三段引物均成功插入质粒内。测序确认后进行大量复制、扩增,提取重组质粒。4、基因转染用含10%新生小牛血清的DMEM培养基培养MGC803胃癌细胞。将对数生长期的细胞于转染前24小时,按每孔1X104个细胞密度接种于6孔培养板,当细胞达85—95%时按照,Lipofectamine 2000说明书进行重组质粒转染。转染后48小时,换为G418培养液,培养2周后,显微镜观察后,挑选克隆。5、Western Blot险测转染后细胞中Cbl-b的表达收集转染后细胞进行裂解,提取细胞蛋白,取20μg处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜,5%脱脂奶封闭1h,一抗孵育1h,TBST洗膜,然后二抗孵育30min,TBST洗膜后加入ECL发光液,孵育5min,暗室中用X片曝光,显影,定影。以未转染细胞系和转染对照质粒的细胞系作为对照,选取表达率为对照组10%以下的细胞株为阳性细胞株。6、MTT法检测四种胃癌细胞的增殖取对数期生长的未转染胃癌MGC803细胞,转染后的空白对照,Cbl-b基因沉默胃癌MGC803细胞,进行胰蛋白酶消化,消化后用培养液制成单细胞悬液,调整细胞浓度至3×104个／ml，按每孔200μl接种于96孔板,37℃分别培养24h,48h,72h后,加入MTT,于相同培养条件下继续培养4h。加入DMSO,在恒温振荡器上振荡10min,室温20min孵育。放入酶标仪中以490nm波长检测光密度值(optical density, OD)。空白调零组A490的OD值均数设为零,以平行孔的平均OD值作为各组的OD值。7、Western Blot检测沉默Cbl-b后对p-ERK及p-AKT的影响收集转染后三种细胞及未转染胃癌MGC803细胞进行Western Blot检测,分别加入抗AKT及抗ERK抗体孵育1h,TBST洗膜,二抗孵育,洗膜,加入ECL发光液,孵育5min,曝光,显影,定影。以未转染细胞系和转染对照质粒的细胞系作为对照,比较AKT及ERK表达的变化。结果1、设计pRNA-U6.1/Neo-cbl靶序列和空白对照序列根据Cbl-b基因序列,设计Cbl-b靶序列2组(shRNA414, shRNA852)进行同源性分析,设计出2组Cbl-b shRNA序列及1组对照靶序列。2、测序结果表明shRNA414,852,和空白对照模板成功构建于pRNA-U6.1/Neo载体上序列完全正确,与目的序列相同。3、空白对照组和Cbl-b基因沉默胃癌MGC803细胞系筛选利用Western Blot检测,选取与未转染的MGC-803细胞Cbl-b表达水平相同的,转染空白对照组细胞为对照组细胞,选取Cbl-b表达水平为未转染组的10%以下的细胞系为Cbl-b基因沉默细胞系。4、对照组和Cbl-b基因沉默胃癌MGC803细胞增殖通过进行MTT检测,发现在细胞增殖24h后,Cbl-b基因沉默胃癌MGC803细胞(shRNA414, shRNA852)增殖逐渐增快,与空白对照及未转染细胞比较差异显著。5、沉默Cbl-b后对p-ERK及p-AKT的影响通过Western Blot检测,在Cbl-b基因沉默细胞中,p-AKT表达较未转染细胞和空白对照细胞明显上调。而在p-ERK表达方面,四种细胞无明显差别。结论1、成功构建泛素连接酶Cbl-b ShRNA质粒。2、成功建立Cbl-b被干涉后表达明显下调的胃癌MGC803细胞系。为进一步研究Cbl-b与EGFR信号转导通路的关系奠定基础。3、Cbl-b基因沉默胃癌MGC803细胞中EGFR通路下游蛋白AK表达上升。