大蒜为百合科植物大蒜（Allium sativum L.）的鳞茎,是一种历史悠久的药食两用植物,具有抗菌、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、防治心脑血管疾病、保肝等多种药理活性,主要含有蒜氨酸、大蒜多糖、大蒜皂苷等活性成分以及氨基酸、无机元素和蛋白质等营养成分。大蒜冻干粉是将新鲜大蒜经全低温速冻、粉碎、冷冻干燥后得到的产物,为略带有蒜味的类白色固体。本研究使用的大蒜冻干粉由新疆特丰药业股份有限公司提供,该企业以大蒜冻干粉为中间体生产的大蒜肠溶片为上市药品（国药准字H65020356）,在临床作为抗感染药物用于治疗急慢性菌痢、肠炎、百日咳、肺部和消化道的真菌感染等。该大蒜冻干粉的主要质量控制指标是测定蒜氨酸的含量,但所建立的方法涉及复杂的生物转化问题,方法有待完善。此外,以大蒜冻干粉为中间体制成的大蒜肠溶片在临床仅被用作抗感染药,其活性未被充分地开发利用。为了完善大蒜冻干粉的质量控制标准与方法,探索大蒜冻干粉其它的药理作用,本研究以大蒜冻干粉为研究对象,对大蒜冻干粉活性成分的含量及指纹图谱、氨基酸和无机元素以及重金属元素的含量以及大蒜冻干粉改善大鼠急性心肌缺血的药效及机制进行研究。采用高效液相色谱法（HPLC）建立蒜氨酸含量测定方法,解决以往方法中存在的生物转化问题,对9种灭酶条件和酶抑制剂（羧甲基羟胺半盐酸盐）的9个用量进行筛选,确定灭活蒜氨酸酶的最佳方法与参数;采用近红外光谱法（NIRS）建立蒜氨酸的定量校正模型,可在大蒜冻干粉的生产现场快速检测蒜氨酸的含量;对大蒜多糖、大蒜皂苷供试品溶液的前处理方法进行优化,采用紫外-可见分光光度法（UV-vis）,测定了样品中活性成分大蒜多糖、大蒜皂苷的含量,补充了质量控制内容;建立了大蒜冻干粉的指纹图谱,使大蒜冻干粉的整体质量控制得到保证;测定了大蒜冻干粉中天冬氨酸、苏氨酸等氨基酸游离及水解形式的含量以及Ca、Mg、P等10种元素的含量,为其营养成分的阐明及重金属污染的风险管理提供依据;采用结扎冠状动脉左前降支的方法,建立了大鼠急性心肌缺血模型,通过考察心律失常发生率、心肌梗死率、心肌酶谱指标、氧化应激因子及炎症因子指标,明确了大蒜冻干粉具有改善大鼠急性心肌缺血的药理作用,并揭示其能够通过调控PI3K/Akt/Nrf2信号通路改善急性心肌缺血,为拓展大蒜冻干粉的临床适应症奠定了基础。主要内容及结果如下:1大蒜冻干粉主要活性成分含量测定及指纹图谱研究1.1基于高效液相色谱法建立大蒜冻干粉中蒜氨酸的含量测定方法采用HPLC建立了大蒜冻干粉中蒜氨酸的含量测定方法。对色谱柱、流速、检测波长、流动相进行了考察,确定蒜氨酸含量测定的色谱条件为:Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,流动相为甲醇-0.28%磷酸二氢钾+0.2%庚烷磺酸钠溶液（pH=2.1）=10:90,流速为0.5 mL/min,检测波长为210 nm,进样量5 μL,色谱柱温35℃。测定蒜氨酸的含量必须要灭活蒜氨酸酶的活性,对9种灭酶条件和酶抑制剂（羧甲基羟胺半盐酸盐）的9个用量进行筛选,确定供试品溶液的制备方法。将本研究建立的含量测定方法与《美国药典》衍生化法的样品测定结果进行配对样本的Wilcoxon符号秩和检验,结果表明,2种方法的测定结果相比无显著性差异（P＞0.05）。15批大蒜冻干粉中蒜氨酸的含量范围为3.31%～3.88%。该方法的建立能够规避生产企业建立的方法中的生物转化问题,能够为生产企业有效控制大蒜冻干粉的质量提供简便、易行、可靠的方法。1.2基于近红外光谱法建立大蒜冻干粉中蒜氨酸的含量测定方法应用NIRS建立快速测定大蒜冻干粉中蒜氨酸含量的方法。扫描50批大蒜冻干粉样品的近红外光谱,并采用HPLC测定其蒜氨酸的含量,运用偏最小二乘法（PLS）建立含量与近红外光谱之间的定量校正模型,并对模型进行优化和评价。利用模型对大蒜冻干粉中蒜氨酸含量进行预测,检验模型的准确度。结果表明,定量校正模型的r为0.9987,RMSEC为0.0245,RMSECV为0.104,平均回收率为99.72%。该方法与HPLC相比,分析速度快,不破坏分析样品,分析过程不受场地限制,不消耗化学试剂,不产生任何污染,适用于多批次大蒜冻干粉中蒜氨酸含量的快速测定,特别适合生产过程中的质量控制。1.3基于紫外-可见分光光度法建立大蒜冻干粉中大蒜多糖的含量测定方法采用UV-vis建立了大蒜冻干粉中大蒜多糖的含量测定方法。通过筛选供试品溶液的提取方法、提取时间以及提取溶剂的量,确定供试品溶液的制备方法为:25 mg大蒜冻干粉,乙醇回流除杂后,加水50 mL,回流提取30 min。采用苯酚-硫酸法进行溶液的显色及测定。制备了大蒜精多糖,经计算得,葡萄糖与大蒜精多糖之间的换算系数为1.35。15批大蒜冻干粉中大蒜多糖的含量范围为66.62%～73.90%。大蒜多糖含量测定方法的建立能够为补充大蒜冻干粉的质量控制标准提供依据。1.4基于紫外-可见分光光度法建立大蒜冻干粉中大蒜皂苷的含量测定方法采用UV-vis建立了大蒜冻干粉中大蒜皂苷的含量测定方法。通过筛选供试品溶液的提取方法、提取溶剂、提取溶剂的量、提取时间以及萃取次数,确定供试品溶液的制备方法为:200 mg大蒜冻干粉,加甲醇40 mL,回流1h,加水饱和的正丁醇萃取4次。采用硫酸-甲醇法进行溶液的显色及测定。15批大蒜冻干粉中大蒜皂苷的含量范围为1.66%～2.24%。大蒜皂苷含量测定方法的建立能够为补充大蒜冻干粉的质量控制标准提供依据。1.5基于高效液相色谱法建立大蒜冻干粉的指纹图谱采用HPLC建立了大蒜冻干粉的指纹图谱。对流动相pH、质量分数以及梯度洗脱条件进行了考察,确定了指纹图谱的色谱条件。建立了 15批大蒜冻干粉的指纹图谱,结果表明,15批大蒜冻干粉的成分基本一致,与对照指纹图谱的相似度均≥0.996,确定了 11个共有峰,经与对照品比对,指认出天冬氨酸和蒜氨酸2个色谱峰。指纹图谱的建立有利于生产企业全面控制大蒜冻干粉的质量。2大蒜冻干粉中氨基酸、无机元素和重金属元素的分析2.1大蒜冻干粉中氨基酸的含量测定采用HPLC测定了 15批大蒜冻干粉中水解色氨酸含量。采用氨基酸自动分析仪对15批大蒜冻干粉中天冬氨酸、苏氨酸等17种氨基酸的游离及水解形式的含量进行了测定。测得的水解色氨酸的含量为1.4 mg/g,测得的天冬氨酸、苏氨酸等17种水解氨基酸的平均含量为112.0 mg/g,18种水解氨基酸的含量总和为113.4 mg/g;测得的15种游离氨基酸的含量总和为36.1 mg/g,蛋氨酸和苯丙氨酸未检测到。明确了大蒜冻干粉中所含的部分氨基酸的状态、种类及含量,为大蒜冻干粉营养成分的阐明提供了依据。2.2大蒜冻干粉中无机元素和重金属元素的含量测定采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定15批大蒜冻干粉中Ca、Mg、P的含量,采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定15批大蒜冻干粉中 Mn、Fe、Cu、Zn、Cd、Pb、Se 的含量。结果表明,Ca、Mg、P、Mn、Fe、Zn、Se 的平均含量分别为 9.13×102、8.10×102、6.18×103、8.38、35.65、23.14、0.05 mg/kg,重金属元素Cu、Cd、Pb含量均符合2020版《中国药典》中的限度规定。明确了大蒜冻干粉中部分无机元素和重金属元素的含量,为大蒜冻干粉元素种类研究、含量研究及重金属污染的风险管理提供了依据。3大蒜冻干粉改善大鼠急性心肌缺血的药效及机制研究采用结扎冠状动脉左前降支的方法制备大鼠急性心肌缺血模型。结果表明,大蒜冻干粉能够降低室早、室速、室颤的发生率及心肌梗死率,降低急性心肌缺血大鼠血清中肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白T（cTnT）、丙二醛（MDA）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平,升高总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）水平,升高心肌组织中磷酸化的磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化的蛋白激酶B（p-Akt）、核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1）的表达,降低Kelch样环氧氯丙胺相关蛋白1（Keap1）的表达。阐明了大蒜冻干粉能够通过降低心肌酶水平、提高抗氧化及抗炎能力,从而发挥改善大鼠急性心肌缺血的作用,其改善急性心肌缺血的作用机制是通过调控PI3K/Akt/Nrf2信号通路实现的。该研究结果为拓展大蒜冻干粉的临床适应症奠定了基础。结论采用HPLC建立了大蒜冻干粉中蒜氨酸的含量测定方法,规避了生产企业方法中的生物转化问题,15批大蒜冻干粉中蒜氨酸含量为3.31%～3.88%;应用NIRS建立了蒜氨酸的定量校正模型,便于多批次样品中蒜氨酸含量的快速测定;采用UV-vis建立了大蒜冻干粉中大蒜多糖和大蒜皂苷的含量测定方法,为补充大蒜冻干粉的质量控制标准提供了依据,15批大蒜冻干粉中大蒜多糖含量为66.62%～73.90%,大蒜皂苷含量为1.66%～2.24%;建立大蒜冻干粉的指纹图谱,有利于全面控制大蒜冻干粉的质量,15批大蒜冻干粉与对照指纹图谱的相似度均≥0.996。通过研究提升了大蒜冻干粉的质量标准。测得大蒜冻干粉中18种水解氨基酸的含量总和为113.4 mg/g,15种游离氨基酸的含量总和为36.1 mg/g,蛋氨酸和苯丙氨酸未检测到,重金属元素Cu、Cd、Pb含量均符合2020版《中国药典》中的限度规定,明确了大蒜冻干粉所含的部分营养成分并为重金属污染的风险管理提供了依据。大蒜冻干粉可以降低急性心肌缺血大鼠室早、室速、室颤的发生率及心肌梗死率,通过减少血清中心肌酶的释放以及发挥抗氧化、抗炎等作用从而起到改善大鼠急性心肌缺血的作用,其作用机制是通过调控PI3K/Akt/Nrf2信号通路实现。阐明大蒜冻干粉具有改善大鼠急性心肌缺血的作用。