【摘 要】
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北京大学医学部基础医学院细胞生物学教研室周柔丽教授近年发现并克隆了一个新的原癌基因,LPAPTM4B。该基因编码两个四次穿膜蛋白质:LAPTM4B-35 和 LAPTM4B-24。LAPTM4B-35
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北京大学医学部基础医学院细胞生物学教研室周柔丽教授近年发现并克隆了一个新的原癌基因,LPAPTM4B。该基因编码两个四次穿膜蛋白质:LAPTM4B-35 和 LAPTM4B-24。LAPTM4B-35 的过表达可导致细胞向恶性转化,并具有一定的成瘤性。而缺失 N 端 91 个氨基酸的 LAPTM4B-24 则与 LAPTM4B-35 的功能相反,可诱导细胞凋亡。 本文以 LAPTM4B 全长 cDNA 序列为模板,通过 PCR 扩增得到LAPTM4B N 端胞质域中 99 个氨基酸的编码序列,并将其克隆到表达GST 融合蛋白的 pGEX-KG 质粒中,构建了重组质粒 pGEX-KG-N1-99, 转化并诱导大肠杆菌JM109后获得了GST-LAPTM4B-N1-99融合蛋白的表达,并通过 Glutathione SepharoseTM 4B 亲和层析柱纯化了该融合蛋白,将其作为免疫原制备鼠源的单克隆抗体 LAPTM4B-N1-99-McAb。利用 ELISA 测定其滴度,Western Blot 鉴定其特异性。利用纯化的LAPTM4B 单克隆抗体 LAPTM4B-N1-99-McAb,检测到该单抗能与LAPTM4B-N1-99 所编码的融合蛋白以及肿瘤细胞中的天然蛋白特异性结合,并用免疫细胞化学染色(IHC)检测到肝癌、肺癌等 5 种肿瘤细胞均表达 LAPTM4B 蛋白。 为了进一步研究 LAPTM4B 基因在肝癌表达失控的原因及其转录调控机制,本文对该基因的启动子区进行了克隆及活性分析。以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列, PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体 pGL3-Basic, 构建的重组
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