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目的1.探讨奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞Y79增殖抑制及诱导凋亡的影响。2.探讨siRNA下调人髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)后增强奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞Y79凋亡的敏感性的影响。方法1.MTT法检测不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2μmol/L)奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞Y7924、48、72h后的增殖抑制作用,以明确其剂量-效应关系;2.碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪检测奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞Y79作用24h后凋亡的影响；3.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性变化；4.PI/Annexin V双染检测奥沙利铂(0.25μmol/L)对siRNA转染下调Mcl-1人视网膜母细胞瘤细胞Y79凋亡的影响,同时将未转染和转染空质粒人视网膜母细胞瘤细胞Y79作为空白和阴性对照；5.Western blot检测奥沙利铂(0.25μmol/L)诱导人视网膜母细胞瘤细胞Y79不同时间(0、6、16、24h), Mcl-1的表达以及siRNA转染下调Mcl-1人视网膜母细胞瘤细胞Y79中Mcl-1的表达。结果1.奥沙利铂抑制人视网膜母细胞瘤细胞Y79增殖MTT法显示不同浓度的奥沙利铂对视网膜母瘤细胞Y79的增殖抑制作用,实验中使用不同浓度奥沙利铂(0、0.125、0.25.0.5、1、2μmol/L)处理人视网膜母细胞瘤细胞Y79,使用MTT法检测细胞存活率。结果表明,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,细胞的存活率下降。0.25μmol/L奥沙利铂处理视网膜母细胞Y79的24、48、72h后细胞的存活率分别为(83.59±0.76)%、(77.30±1.24)%、(61.41±1.39)%；与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.奥沙利铂诱导人视网膜母细胞瘤细胞Y79凋亡0.25μmol/L奥沙利铂刺激人视网膜母细胞瘤细胞Y7924h后,PI流式检测,诱导人视网膜母细胞瘤细胞Y79的凋亡率分别为(36.23±0.25)%(P<0.05)。3.奥沙利铂诱导人视网膜母细胞瘤细胞Y79的Caspase-3激活作用0.25μmol/L奥沙利铂刺激人视网膜母细胞瘤细胞Y79后,对Y79细胞Caspase-3激活有明显的增强作用,为(5.76±0.25)%,与对照组(1.96士0.15)%比较差异有统计学意义(P<0.01)。4.奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞Y79中Mcl-1的表达的影响实验中用0.25μmol/L奥沙利铂刺激人视网膜母细胞瘤细胞Y79后,培养6,16,24h后收集细胞,提取蛋白,用Western blot方法检测Mcl-1蛋白的表达。从实验可以看出,奥沙利铂可诱导人视网膜母细胞瘤Y79中Mcl-1的表达增强。5. pSH1Si-Mcl-1对人视网膜母细胞瘤细胞Y79Mcl-1表达的抑制作用为观察下调Mcl-1后人视网膜母细胞瘤Y79Mcl-1的表达,实验中分别转染空质粒和不同序列的pSH1Si-Mcl-1质粒到人视网膜母细胞瘤细胞Y79,转染6h后更换新鲜培养基,次日收集细胞,提取蛋白,用Western blot的方法检测Mcl-1蛋白的表达,显示Mcl-l-homo-991具有明显抑制Mcl-1表达的作用。6.下调Mcl-1的表达对人视网膜母细胞瘤细胞Y79凋亡的促进作用为观察下调Mcl-1后,奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞Y79凋亡的作用。实验中对不同因素处理的细胞进行PI/Annexin V染色,并通过流式细胞仪分析,观察敲减Mcl-1后诱导人视网膜母细胞瘤细胞Y79早期凋亡的作用。0.25μmol/L奥沙利铂作用于人视网膜母细胞瘤细胞Y7924h,诱导Y79细胞的凋亡率为10.8%,与阴性对照组5.8%比较,差异无统计学意义(P>0.05)。将Mcl-1进行敲减,并且敲减后用0.25μmol/L奥沙利铂处理24h,诱导人视网膜母细胞瘤细胞Y79的凋亡率分别为21.0%和48.2%,与阴性对照组及奥沙利铂组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。上述表明,奥沙利铂本身并不诱导细胞产生凋亡,但敲减Mcl-1后可增加奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞产生的凋亡。结论1.奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞Y79具有增殖抑制作用,且随着剂量浓度的加大和作用时间的延长,细胞存活率随之降低,但在低浓度下作用不明显,作用机制可能与凋亡关键蛋白Mcl-1的抗凋亡作用相关。2.奥沙利铂诱导后,人视网膜母细胞瘤细胞Y79中Mcl-1的表达明显增加,其作用机制可能与Mcl-1的抗凋亡作用有关,由此产生了耐药。3.下调Mcl-1后,人视网膜母细胞瘤细胞Y79的细胞存活率明显下降,凋亡率明显上升,由此证明Mcl-1在人视网膜母细胞瘤细胞Y79具有保护作用。