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原料乳作为乳制品加工的重要原料,其微生物污染情况是影响乳品加工全链条的关键因素,与乳及乳制品的质量安全息息相关。原料乳在低温贮运过程中,嗜冷菌会逐渐生长繁殖成为优势菌群,其可能会分泌耐热性的蛋白酶和脂肪酶,导致乳及乳制品出现营养价值降低、不良风味、凝胶化和分层等多种质量问题,进一步缩短乳制品的货架期。此外,原料乳中嗜冷菌的浓度及群落多样性受多种因素的影响,如季节因素、贮存条件、地域因素、牧场环境及喂养方式等。因此,对不同季节原料乳中嗜冷菌多样性及其主要水解酶特性的研究对保障原料乳及乳制品的品质安全极其重要。本研究以原料乳中的嗜冷菌为研究对象,一方面,利用传统培养方法对嗜冷菌进行培养鉴定,确定嗜冷菌浓度及分类学地位;进一步结合基于Pacbio平台的单分子实时(SMRT)测序技术,通过分类学组成分析、组间分类学组成差异分析、alpha和beta多样性分析进一步揭示嗜冷菌群落多样性及其季节差异性。另一方面,利用琼脂扩散法结合偶氮酪蛋白及对硝基苯酚法测定优势嗜冷菌分泌主要水解酶能力,进一步模拟巴氏杀菌和超高温瞬时杀菌温度对酶进行热处理以探究酶的耐热性。本研究获得的结果如下:(1)原料乳中嗜冷菌浓度具有季节差异性。20份原料乳样品中嗜冷菌的平均浓度为3.73log CFU/m L,其中夏季样品嗜冷菌浓度为3.92 log CFU/m L,冬季样品嗜冷菌浓度为3.54 log CFU/m L。整体上夏季样品的嗜冷菌浓度显著高于冬季样品(p<0.05)。(2)基于传统培养方法,原料乳中嗜冷菌显示较高多样性。16S r DNA序列鉴定结果显示,600株嗜冷菌分为45个属和120个种,以及2个潜在的新属和3个潜在的新种。整体上,假单胞菌(Pseudomonas;153株,25.5%)为分离频率最高的菌属,且在样品中分布广泛(18/20),荧光假单胞菌(P.fluorescens;31株,5.2%)为分离频率最高的菌种。其中,夏季组共分离出40个属和83个种,而冬季组的嗜冷菌群落多样性明显低于夏季组,共分离出27个属和75个种。夏季组与冬季组的优势菌属均为Pseudomonas。棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)占夏季组分离菌株总数比例最高,鱼乳球菌(L.piscium)占冬季组分离菌株总数比例最高。(3)进一步结合SMRT测序技术,分析原料乳中嗜冷菌群落组成。整体上,变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门,短波单胞菌属(Brevundimonas)以及泡囊短波单胞菌(B.vesicularis)在原料乳中的相对丰度最高。而夏季组中厚壁菌门(Firmicutes,28.6%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,12.2%)丰度显著高于冬季组(Firmicutes,7.1%;Bacteroidetes,7.1%)。属水平上,夏季组的优势属为肠球菌(Enterococcus,15.6%),冬季组的优势属为Brevundimonas(14.6%)。种水平上,夏季组的优势种为粪肠球菌(E.faecalis,15.6%),冬季组的优势种为B.vesicularis(13.9%)。(4)明确了不同季节原料乳样品中嗜冷菌群落结构的组间差异性。通过组间分类学组成差异分析,发现冬季组和夏季组共计有103个分类单元具有显著差异,其中存在3个具有显著差异的菌门,分别为Proteobacteria、Firmicutes和放线菌门(Actinobacteria),22个组间差异显著的属和44个组间差异显著的种。通过alpha多样性分析,发现夏季样品的Shannon指数和Simpson指数均显著高于冬季样品(p<0.05),说明夏季原料乳菌群多样性显著高于冬季样品。此外,beta多样性分析结果显示不同季节样品分组模型良好,进一步揭示冬季组嗜冷菌群落多样性与夏季组具有差异性。(5)存在68.8%的嗜冷菌分离株具有分泌蛋白酶或脂肪酶的能力。通过琼脂扩散法对嗜冷菌分泌主要水解酶能力进行可视化鉴定,发现除Enterococcus和莫拉菌属(Moraxella),其余18个优势菌属均能够分泌蛋白酶或脂肪酶,其中Pseudomonas和Lactococcus产酶能力最强。(6)优势嗜冷菌分泌的主要水解酶具有较强耐热性。通过偶氮酪蛋白和对硝基苯酚法测定优势嗜冷菌的初始酶活,发现P.fluorescens分泌的蛋白酶活性最高(10.8ΔΑ/(h·m L)),桂林不动杆菌(A.guillouiae)分泌的脂肪酶活性最高(7.3μmol/(min·m L))。耐热性研究发现,70%以上的优势嗜冷菌分泌的水解酶具有耐热性,P.fluorescens的蛋白酶耐热性最强,Chryseobacterium carnipullorum的脂肪酶耐热性最强。