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生物钟作为生物体内控制时空节律的生理机制,影响着多种复杂的生物功能。家蚕是唯一被完全驯化和畜牧化家养的昆虫,也是中国特色的无脊椎模式动物,是农林害虫—鳞翅目昆虫唯一的模式昆虫。家蚕生物钟分子作用环路的核心成员,在蛋白质分子进化和相互作用网络等方面,与哺乳动物甚至与果蝇和线虫等经典模式昆虫有较大差异。研究家蚕的生物钟分子作用机制,对于深入探明鳞翅目昆虫的复杂生理行为分子机制,进一步有效开展家蚕饲养与鳞翅目害虫防治具有重要的作用。为了探究家蚕生物钟与先天免疫系统之间的关联,本文利用本实验室创制的生物钟周期基因(Per)敲除突变体纯系(Per-/-),系统研究了突变体家蚕对高温逆境环境和染菌生物侵染后的存活时间变化及其影响机制。主要结果如下:(1)周期基因敲除家蚕(Per-/-)的转录和蛋白水平验证利用40种生物的PER蛋白序列进行系统发育进化树的构建,发现家蚕PER蛋白与烟草天蛾同源性最高(约90.00%),与拟暗果蝇等双翅目昆虫也有较高同源性(约70.00%),但与脊索动物之间同源性只有60.00%左右。家蚕PER蛋白具有保守的PAS和PAC结构域且排列方式和其他物种类似。PER蛋白三维结构预测显示,其与人类的PER蛋白结构相类似(49.00%)。家蚕基因组仅编码单拷贝的PER,暗示家蚕体内唯一的PER蛋白,可能承担高等动物哺乳类多个(PER1/PER2/PER3)的复杂功能。基于家蚕周期基因Per的结构特点,对实验室通过TALEN基因编辑方法创制的周期基因Per敲除突变体系统(Per-/-)进行鉴定,敲除突变体的Per基因在第1个外显子的27 bp处,由C突变为A,并在28 bp和29 bp中间插入了 19个碱基,导致27-29 bp处编码的氨基酸由天冬酰胺变为赖氨酸,并在插入的19 bp之后引入了一个终止密码子,导致转录的提前终止和PER蛋白质的缺失。(2)敲除周期基因未改变家蚕正常饲养环境下的存活时间,但缩短了高温下的存活时间,延长了细菌感染后的存活时间。敲除周期基因Per的家蚕,在正常饲养环境中,摄食量和消化率显示的摄食行为有变化,在生长最快速的5龄,幼虫生长发育与野生型无显著差异,存活时间也无明显差异,但5龄幼虫在32℃逆境高温下,生存中值(T50)比野生型缩短了25.00%。5龄期经口感染E.coli和S.aureus,敲除突变体与野生型之间存活时间无显著差异,但循环血液注射感染E.coli和S.aureus后,敲除突变体的T50比野生型分别延长了 11.11%和25.00%。接菌后18 h,敲除突变体血淋巴中的菌载量分别只有对照野生型的40.00%和14.00%,表现出对E.coli和S.aureus较强的抗性和清除能力。(3)敲除突变体通过提高抗菌肽基因表达和ROS积累量来更有效地清除细菌血细胞吞噬能力检测结果显示,敲除突变体与野生型之间没有显著差异,但5龄幼虫期吞噬相关基因ActinA1、Ced6、TetraspaninE的表达模式发生了与野生型相反或交替上升的差异表达模式。敲除突变体血淋巴中黑化免疫相关的黑色素合成酶PPO,虽然在染菌后的时间表达谱相比于野生型发生了模式变化,但黑色素水平与血淋巴黑化免疫能力无显著差异。敲除突变体家蚕幼虫体内,染菌后抗菌肽基因Enbocin、Moricin的表达较野生型家蚕显著上调,Toll信号通路的激活程度也显著高于野生型,但是两种细菌之间的模式有所差异。敲除突变体染菌后的血细胞中,ROS含量较野生型显著升高。敲除家蚕Per基因,虽然影响了血细胞吞噬相关基因和黑化作用相关基因的表达模式,但没有最终改变循环血液系统对家蚕染菌后的细菌清除能力,敲除突变体依赖染菌后高度激活的Toll信号通路及抗菌肽基因的快速高效上调表达,增强了血淋巴通过抗菌肽发挥的抑菌能力,提高了血细胞中通过ROS发挥杀菌能力,最终实现清除入侵细菌的作用。结论:敲除生物钟周期基因的突变体家蚕(Pe-/-),缩短了非生物逆境如高温环境下的存活时间,但提高了幼虫抗菌肽基因表达和ROS积累量来更有效的清除细菌,提高了对血淋巴中入侵细菌的抵抗性。