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第一部分超促排卵对卵母细胞和早期胚胎线粒体的影响目的：线粒体是供应能量、调节钙稳态的重要细胞器,也是唯一能遗传DNA的细胞器,与卵子和胚胎发育潜能相关。在卵母细胞成熟过程中,线粒体发生数量、形态分布和功能的一系列变化。超促排卵使卵巢超越生理调控同步发育多个卵子,其干预阶段正是卵母细胞胞质成熟、线粒体储备完善的阶段。多项研究提示超促排卵可以改变卵巢微环境,获得的卵子质量下降,因此超促排卵应用的安全性值得探讨。本项目通过小鼠模型,对比超促排卵和非超促排卵卵子体外受精后发育潜能,同时检测卵子和早期胚胎线粒体的数目、形态、功能、线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的异质性以及卵巢组织的氧化损伤和抗氧化能力,以探讨超促排卵时卵巢环境改变对卵母细胞线粒体的影响以及与发育潜能的关系。方法：采用C57BL/6J小鼠,注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)为超促排卵组,自然动情期注射HCG为对照组。收集两组所获得的卵子和体外受精后所获的胚胎。采用实时PCR法检测单卵/胚胎mtDNA拷贝数、荧光素酶法检测单卵/胚胎ATP、JC-1染色检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm)、MitoTracker Red染色观察线粒体分布、电镜观察线粒体超微结构以及用变性高效液相色谱法检测mtDNA的异质性。对比两组间的卵子成熟度、胚胎发育状况、线粒体各指标的差异以及卵巢组织的氧化损伤产物和总抗氧化能力的差异。结果：1.与对照组相比,超促排卵组取卵成功率高(P<0.01),获卵总数多(P<0.01),受精卵多(P<0.01),卵裂胚胎数多(P<0.01),形成囊胚数多(P<0.01),但获得的不成熟卵和低潜能卵子比例高。2.超促排卵组获得的MⅡ卵和受精卵的线粒体拷贝数低于对照组(P<0.01,P<0.05),获得的2细胞胚胎和囊胚线粒体拷贝数与对照组差异无显著性。3.超促排卵组获得的MⅡ卵和受精卵的ATP含量低于对照组(P<0.01,P<0.05),获得的2细胞胚胎和囊胚的ATP含量与对照组差异无显著性。4.超促排卵组获得的MⅡ卵的ΔΨm低于对照组(P<0.01),获得的2细胞胚胎和囊胚的ΔΨm与对照组差异无显著性。5.电镜显示超促排卵组获得的部分MⅡ卵线粒体稀少,MitoTracker Red荧光染色显示超促排卵组MⅡ卵线粒体分布极性聚集比例高于对照组(P<0.01)。6.超促排卵组与对照组均未检测到mtDNA D-loop区的异质性。7.单次超促排卵的卵巢氧化损伤产物与对照组相比无明显差异,总抗氧化能力高于对照组(P<0.05)。结论：1.超促排卵增加取卵成功率、增加获卵总数和高发育潜能卵子总数。2.超促排卵同时也募集了不成熟卵和线粒体储备低下的卵子,这些卵子在随后的受精和胚胎发育过程中被淘汰。超促排卵获得的囊胚其线粒体数量、功能与对照组无显著差异。3.单次超促排卵与对照组相比不显著增加卵子mtDNA D-loop区的突变频率。第二部分子宫内膜异位症腹腔液对早期胚胎线粒体的影响目的：子宫内膜异位症(内异)与不孕存在很强的相关性。轻度盆腔内异患者没有输卵管和卵巢的解剖异常但也常伴有不孕。内异是炎症性和免疫性疾病。内异腹腔液含有炎症因子、活性氧和活性氮,能抑制胚胎发育,但机制未明。线粒体是胚胎发育潜能的重要决定因素,对环境极其敏感,是炎症因子和各种自由基作用的靶细胞器,易受损而诱发细胞凋亡。本研究通过分析轻度内异不孕患者助孕治疗的临床资料、其腹腔液一氧化氮(nitric oxide, NO)的含量以及腹腔液对小鼠胚胎线粒体的影响,来探讨轻度内异盆腔微环境对早期胚胎的影响,寻求其相关不孕的最佳处理方式。方法：对腹腔镜探查证实为轻度内异患者进行术后随访,与输卵管性不孕组对比,分析两组体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)台疗的临床特征。同时收集腹腔液检测其NO代谢物的含量,用含不同浓度硝普钠(sodium nitroprusside, SNP,是NO的供体)的培养液孵育鼠胚,观察NO对早期胚胎发育的影响。将腹腔液按10%比例掺入培养液进行鼠胚培养,计算鼠胚卵裂率和囊胚形成率,同时用实时PCR法测定单胚胎mtDNA拷贝数、荧光素酶法测定单胚胎ATP、JC-1染色检测胚胎线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm)、电镜观察线粒体超微结构,对比组间胚胎线粒体各指标的差异。结果：1.轻度内异患者IVF受精率显著低于输卵管性不孕(P<0.05),而获卵率、卵裂率、优胚率、种植率、妊娠率和流产率两组之间均无显著性差异。2.内异组腹腔液NO显著高于对照组(P<0.01)。含10-6M和10-4M SNP培养液孵育鼠胚的卵裂率和囊胚形成率降低(P<0.01),而10-8M组卵裂率和囊胚形成率变化不显著。3.内异组腹腔液孵育鼠胚的卵裂率和囊胚形成率低于非内异组和对照组(P<0.01)。4.内异组腹腔液孵育鼠胚的2细胞期和4细胞期胚胎的ATP含量、ΔΨm高于非内异组和对照组,差异有统计学意义,而组间线粒体拷贝数差异无显著性。结论：1.轻度内异患者IVF-ET治疗的疗效与输卵管性不孕无显著差异。2.轻度内异腹腔液中NO含量高于对照组,而高浓度NO可以抑制早期胚胎发育。3.轻度内异腹腔液能抑制小鼠早期胚胎发育、改变胚胎线粒体功能状态。