水稻(Oryza sativa L.)是我国重要的粮食作物,在保障国家粮食安全中起到重要作用。由于近年极端气候频发(日益严重的频繁干旱、极端温度),水稻受到非生物胁迫因素的影响加剧,加之人口增长和生态环境的压力,传统的水稻育种方法难以满足品种改良的需求。因此,通过现代生物学技术提高水稻对非生物胁迫的抗性是保证粮食安全的重要途径。作物在遭受各种非生物胁迫时都会大量产生活性氧,由此受到次级的氧化胁迫伤害,不及时被清除将直接损伤细胞、抑制生长。SOD是抵御氧化伤害的第一道防线,直接决定了胁迫下活性氧的清除效率,在作物抗性分子改良的研究中受到广泛关注。目前已有很多利用超表达SOD基因提高植物应对冷、热、盐、旱、氧化胁迫抗性的成功范例。而叶绿体是植物有氧代谢最为旺盛的细胞器,也是体内活性氧02-·的主要来源。叶绿体02-·可能同时具有损伤破坏和信号传递的双重作用,因此快速精确的调节叶绿体内02-·浓度对合理的逆境响应起至关重要的作用。故研究水稻叶绿体SOD的功能,探索SOD对水稻叶绿体内活性氧清除和信号传递的控制模式,阐明SOD的分子机制,能够为抗逆水稻的分子改良提供理论参考。本研究以水稻日本晴为材料,克隆了水稻中的7种SOD (OsFSDl,OsFSD2,OsCSD1,OsCSD2,OsCSD3,OsCSD4,OsMSD1)全长cDNA序列,运用水稻叶肉细胞原生质体瞬时表达的方法对7种SOD进行亚细胞定位,并对定位于水稻叶绿体的SOD进行生化分析和超表达实验,还通过对OsFSDs的突变体分析和干涉实验进行功能验证进而探索OsFSDs的分子作用机理。具体研究结果如下：1、从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库搜索到水稻的SOD基因序列(LOC_Os07g46990, LOC_Os03g22810, LOC_Os03g11960,LOC_Os08g44770, LOC_Os06g05110,LOC_Os06g02500, LOC_Os05g25850),设计各自的特异性引物,以水稻总cDNA为模板用高保真酶KOD进行PCR扩增,获得预期大小的片段,连接到PEASY-T载体上,将菌落PCR正确的克隆测序,并进行BLAST比对。其中OsFSD2尚未见克隆的报道,因此我们首次克隆了一个水稻铁型SOD的基因。2、利用已克隆的基因经亚克隆连至改造的PUC18载体的阅读框中,并将SOD融合于GFP的5’端,整个编码框由35S的启动子驱动。将上述载体通过PEG4000介导的方法转入水稻叶肉细胞的原生质体中来探索水稻各SOD的亚细胞定位。根据共聚焦显微镜观察到的结果推测：OsCSD1、OsCSD2、OsCSD3可能定位于细胞质中,而OsCSD4、OsFSD1、OsFSD2可能定位于叶绿体中,OsMSD1可能定位于线粒体中。其中OsFSD2可能是均匀分布在叶绿体中,而OsFSD1则呈点状分布,根据拟南芥中FSDs的定位情况同时考虑水稻OsFSD1的进化关系,我们推测OsFSD1可能定位于叶绿体的类核中。3、通常SOD是以复合体的形式在植物体中发挥生理功能,因此本实验用酵母双杂交和GST-pull-down两种方法进行体外验证,初步确定在叶绿体中的三种SOD的相互作用关系。同时采用双分子荧光互补实验(BIFC)在体内验证三者之间的相互作用关系。实验结果指出：OsFSD1自身可以发生相互作用,OsFSD1和OsFSD2可以发生相互作用,OsFSD2自身不能发生相互作用,OsCSD4没有观察到与其他蛋白的相互作用。BIFC实验显示OsFSD1和OsFSD2发生相互作用产生的黄色荧光在叶绿体中呈点状分布,与OsFSD1的亚细胞定位结果很接近,我们推测发生相互作用的部位是叶绿体的类核。4、本实验为了探索发生相互作用蛋白所具有的酶活性,用活性胶和“超氧化物歧化酶检测试剂盒-WST法”两种方法测定OsFSDs在体外的活性。结果表明：在体外OsFSD1具有酶活性,并且随着其蛋白量的增加,其活性也在增加；在体外OsFSD2没有酶活性。如果实验前先将OsFSD1和OsFSD2等量4℃结合孵育,发现孵育后的混合蛋白的酶活性比等量的OsFSD1的酶活性有明显的增强。我们推测：植物遭受突发的逆境胁迫时,OsFSD1的表达量不可能瞬间剧增,但是它可以招募叶绿体的OsFSD2进入类核,进而形成异源二聚体来迅速提高其生物活性来响应逆境胁迫。5、为了研究定位于水稻叶绿体中的三种SOD的功能,本实验构建了超表达载体和RNAi载体进行水稻遗传转化实验,并对从RISDDB (Rice T-DNA insertion sequence database)突变体库中得到的两种铁型SOD的突变体进行鉴定实验。结合甲基紫精(Methylviologen,MV,造成光合系统Ⅱ的O2-·积累)处理超表达载体的T2代幼苗(测量被处理叶片的FV/FM值)的实验,结果表明：超表达OsFSD2植株的抗氧化胁迫能力是三者中最强的；超表达OsFSD1次之；而超表达OsCSD4最差。文献调研发现OsCSD4在植物体中不可能出现高倍数的超表达,因此其抗氧化胁迫能力最差。但是三者都比对照组日本晴的抗氧化胁迫能力好。鉴定出的OsFSD2的纯合突变体出现了严重的白化表型；而该基因RNAi载体的转基因苗也有98%是白化苗,RT-PCR的结果显示其OsFSD2的基因表达的抑制效率都在0.3以下。因此我们认为OsFSD2在水稻幼苗的生长发育过程起着重要的作用,具体机理还需要进一步深入研究。