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乙肝病毒感染是全球性的公共卫生问题,在我国危害尤其严重,HBV转录后调节涉及多个环节,HBV转录后调节基序(HBV post-transcriptional regulatory element ,HPRE)的作用是其中重要一环。HPRE最早发现是在1993年,是HBV基因组上的一个片段(1151nt-1684nt),现有的研究认为这段序列在转录后水平发挥着顺式调节作用,抑制转录体的剪接同时促进转录体由细胞核向细胞浆的转运。虽然HPRE的作用机制至今还不是完全清楚,但比较一致的认为是HPRE依赖与细胞蛋白的结合来发挥它的作用,因此验证HPRE结合蛋白就可以帮助明确HPRE在HBV RNA输出中发挥的作用。我室研究人员,利用噬菌体表面展示技术进行筛选新的与HPRE-RNA结合的蛋白分子,发现了一种新的蛋白,经鉴定为TIA-1(cytotoxic granule-associated RNA binding protein 1)蛋白。为了进一步分析TIA-1对HPRE的功能影响,开展了本研究。目的:表达纯化大量TIA-1-GST蛋白及HPRE-Biontin-RNA,验证两者之间的结合作用,并且纯化TIA-1各亚片断的GST融合蛋白,鉴定TIA-1与HPRE作用部位。利用检测系统pDM138及pDM138-HPRE进一步验证TIA-1对HPRE是否发挥作用。最后转染HepG2.2.15细胞检测TIA-1对HBV的功能有何影响。方法:1用XhoI酶切pGEM-HPRE质粒DNA,得一线性模板,利用T7RNA聚合酶,以体外转录的方法合成HPRE-Biotin RNA;在BL21细菌里大量诱导表达及纯化TIA-1-GST融合蛋白及GST蛋白。2 M-280 Streptavidin磁珠特异性结合Biotin,用磁力座纯化混合物,将纯化后的洗脱液做Western Blot分析,用GST单抗检测有无蛋白存在; Glutathione Sepharose 4B纯化柱特异性结合GST蛋白,将纯化后的洗脱液做RT-PCR,检测有无HPRE的RNA存在。3将蛋白TIA-1的真核表达质粒pcDNA3-FLAG-TIA-1和pDM138及pDM138-HPRE分组,按照一定比例转染细胞HepG2,通过ELISA检测报告基因CAT的表达验证蛋白TIA-1与HPRE RNA的相互作用。4将TIA-1蛋白的真核表达质粒pcDNA3-FLAG-TIA-1按照一定比例转染HepG2.2.15细胞,通过ELISA检测S抗原及e抗原的表达量和统计学分析验证蛋白TIA-1对HBV的影响。结果: 1 Western Blot用GST抗体检测,样品TIA-1-GST+HPRE-Biotin RNA有蛋白带存在,而阴性对照GST+HPRE-Biotin RNA没有条带。RT-PCR电泳结果显示样品TIA-1-GST+HPRE-Biotin RNA有HPRE RNA ,而阴性对照GST+HPRE-Biotin RNA没有。2报告基因CAT表达量经统计学处理后显示:转染质粒pDM138-HPRE的细胞能增加CAT表达,同时转染质粒pDM138-HPRE和pcDNA3-FLAG-TIA-1之后,CAT的表达受到明显抑制。3检测S抗原及e抗原的表达量,统计学处理后显示:与正常的HepG2.2.15细胞相比,转染pcDNA3-TIA-1质粒的HepG2.2.15细胞,其e抗原的表达量有明显的增高,而S抗原表达量有明显的降低。结论:TIA-1与HPRE可以发生结合作用,为HPRE的抑制性结合蛋白,能调节HBV S抗原和e抗原的表达。